Противірусна активність НЧС

На сьогодні віруси становлять серйозну загрозу для медицини та суспільства, є однією з основних причин захворюваності та смертності населення. Незважаючи на успіхи у розробці лікарських засобів для противірусної терапії, сучасні схеми лікування не здатні повною мірою контролювати перебіг інфекцій. Тому постає потреба у необхідності створення нових високоефективних противірусних препаратів (Esteban D., 2010).

Протягом останніх 50 років бурхливого розвитку набули нанотехнології — новий напрямок науки з потенціалом вирішення актуальних проблем у багатьох галузях господарства, у тому числі в медицині. Особливий інтерес вчених у цьому аспекті викликають наночастинки металів та оксидів металів, адже такі наноструктури виявляють унікальні фізико-хімічні, біологічні та фармакологічні властивості, мають виражений бактерицидний, фунгіцидний та, що особливо важливо, вірицидний потенціал [2].

На сьогодні серед наноструктур металів із вираженими біоцидними властивостями найбільш вивченими є наночастинки срібла і міді, які активно застосовують при розробці нових лікарських засобів, а також створенні виробів медичного призначення, синтетичних тканин та пакувальних матеріалів із протимікробною активністю, пристроїв для знезараження води [3].

До відкриття антибіотиків срібло широко застосовували як антисептик при лікуванні відкритих ран та опіків. Нині, завдяки розвитку нанотехнологій, сполуки цього металу повертаються в медицину у ролі нових високоефективних протимікробних засобів. Відомо, що наноматеріали виявляють більшу реакційну здатність порівняно з відповідними структурами інших розмірних діапазонів. Це пояснюється, зокрема, унікальними фізико-хімічними властивостями таких сполук, високим значенням співвідношення площі вільної поверхні до об’єму матеріалу. Цей феномен нанорозмірності лежить в основі вираженої біологічної активності наноструктур металів, зокрема срібла [4].

Доведено, що наночастинки срібла мають широкий спектр противірусної активності, впливають на мікроорганізми родин Retroviridae, Hepadnaviridae, Paramyxoviridae, Herpesviridae, Poxviridae, Orthomyxoviridae та Arenaviridae. Також відомо, що вірусна резистентність до наносрібла розвивається повільніше, ніж до інших противірусних лікарських засобів. Це пояснюється, зокрема, мультивалентністю чи багатогранністю взаємодії наноструктур з компонентами поверхні вірусів та рецепторами біомембрани, що призводить до запобігання проникненню збудника у клітину. Зазначений аспект також пояснює широкий спектр противірусної активності наночастинок срібла, що не залежить від родини вірусів [5].

На сьогодні відомо, що наночастинки срібла проявляють вірицидну дію відносно таких збудників, як вірус гепатиту В, вірус імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1), вірус простого герпесу типу 1 (ВПГ-1), респіраторно-синцитіальний вірус, вірус віспи мавп, вірус грипу тощо. Широкий спектр активності, на думку ряду авторів, дозволяє назвати наночастинки срібла «захисним нанощитом проти вірусної інфекції». Це спостереження є важливим аргументом на користь розробки відповідних лікарських засобів, адже такі субстанції потенційно матимуть високу ефективність при терапії інфекцій, викликаних вірусами невідомої природи або збудниками, проти яких досі не розроблені інші ефективні методи боротьби, зокрема спричинених вірусом Ебола.

Точний механізм противірусної активності наночастинок срібла достеменно не встановлений, існують декілька поглядів на це питання. Так, наносрібло може взаємодіяти з капсидом та/чи білками поверхні вірусу, а також із компонентами клітинної мембрани, перешкоджаючи контакту вірусу з клітиною та його проникненню всередину. Також наночастинки срібла здатні вступати у реакцію з вірусним геномом всередині клітини або з вірусними та клітинними факторами, необхідними для реплікації вірусу (рисунок 3).

Рис 3. Механізми противірусниї дії наночастинок срібла.

Можливі механізми противірусної дії наночастинок срібла:

1) взаємодія з капсидом та/чи білками поверхні вірусу з подальшою нейтралізацією біологічної активності збудника;

2) взаємодія з компонентами біомембрани для запобігання контакту вірусу з клітиною та проникнення останнього у цитоплазму;

3) взаємодія з вірусним геномом;

4) взаємодія з вірусними та клітинними факторами, необхідними для реплікації.

Встановлено, що наносрібло інгібує ВІЛ-1 шляхом взаємодії з розміщеними у капсиді сульфгідрильними групами ділянки глікопротеїну gp120, який відповідає за зв’язування вірусу з рецептором CD4 та проникнення у клітину. На основі цих результатів автори розробили лікарську форму наночастинок срібла з полівінілпіролідоном (ПВП) для застосування як вагінальний протимікробний засіб. Ефективність отриманої експериментальної системи оцінювали у досліді на культурі клітин цервікального каналу людини — моделі in vitro, що симулює умови in vivo. При додаванні у середовище вкритих ПВП наночастинок срібла у концентрації 0,15 мг/мл спостерігалося запобігання передачі ВІЛ-1.

Також вивчали вплив на цей збудник наносрібла різної будови — без покриття та функціоналізованого ПВП або бичачим сироватковим альбуміном (БСА). Найбільш виражену противірусну активність мали нативні наночастинки, хоча всі три варіанти наноструктур були ефективними. Наносрібло пригнічувало початкові етапи реплікації ВІЛ-1 шляхом запобігання взаємодії глікопротеїну gp120 із рецепторами CD4 та контакту збудника з клітиною[5].

За допомогою скануючої та трансмісійної електронної мікроскопії кільцевого темного поля при великих кутах встановлений впорядкований характер взаємодії наночастинок срібла з ВІЛ-1. Виявилося, що глікопротеїни gp120 капсиду розміщені один від одного на відстані приблизно 22 нм, а наночастинки срібла на поверхні вірусу розміщуються з періодичністю приблизно 28 нм. Такі результати свідчать на користь підтримки гіпотези про взаємодію наночастинок із цими глікопротеїнами та допомагають встановити зв’язок між розміром і ефективністю наносрібла. Найбільш виражену противірусну дію мали наноструктури 1–14 нм, при подальшому збільшенні розмірів наночастинки втрачали здатність приєднуватися до капсиду вірусу, оскільки це порушувало впорядкованість їх розміщення [6].

В іншому дослідженні описано цікавий спосіб застосування наносрібла як покриття для поліуретанових презервативів. Ці вироби мали високу інгібуючу активність щодо ВІЛ-1, а також ВПГ-1 та -2, біоцидно впливали на широкий спектр бактерій та грибів. Таким чином, наночастинки сріб­ла проявили себе як ефективна протимікробна субстанція у боротьбі зі збудниками захворювань, що передаються статевим шляхом.

Досить докладно вивчали противірусну активність наночастинок срібла і відносно ВПГ-1. Відомо, що одним із рецепторів для контакту цього збудника із клітиною-мішенню є гепарансульфат. Клітини з дефіцитом цього компонента характеризуються виражено зниженою чутливістю до ВПГ-1. У досліді наночастинки срібла були модифіковані оболонкою з меркаптоетан-сульфонату, що імітувала гепарансульфат. Вчені встановили, що таке наносрібло виражено інгібує ВПГ-1-інфекцію, запобігаючи зв’язуванню вірусу з клітинами-мішенями та потраплянню всередину останніх. Зауважимо, що розчин меркаптоетан- сульфонату та немодифіковані наночастинки металу, застосовані окремо, не впливали на інфекційність вірусу. Це дозволило зробити припущення про важливість просторової орієнтації функціональних груп, розміщених на «ядрі» (наносріблі), для реалізації противірусної активності [7].

Також наявні результати дослідження, що свідчать про здатність наночастинок срібла інгібувати реплікацію вірусу гепатиту В шляхом приєднання безпосередньо до вірусної ДНК, а також пригнічувати синтез вірусної РНК та формування віріонів. При вивченні противірусної активності монодисперсного наносрібла різних розмірів встановлено, що найбільш виражену дію мали частинки розмірами 10 та 50 нм. Активність наночастинок срібла порівнювали з відповідною характеристикою наночастинок золота розміром 10 нм, а також інших сполук срібла різного ступеня окиснення. Результати показали значно більш виражений інгібуючий вплив на вірус гепатиту В саме наносрібла.

Встановлений факт інгібування наночастинками срібла вірусу грипу штаму A/New Caledonia/20/99(H1N1) шляхом руйнування глікопротеїнів, зокрема гем­аглютиніну (ГА), що було визначено при проведенні реакції гемаглютинації. Кожний мономер ГА має два дисульфідні зв’язки, які розриваються перед взаємодією з клітиною-мішенню для забезпечення належного контакту вірусу з останньою. Сульфгідрильні групи, що утворюються внаслідок цього процесу, є найбільш імовірними ділянками взаємодії вірусу з наночастинками срібла. Природна спорідненість наносрібла до сульфгідрильних груп та дисульфідних зв’язків у цьому випадку відіграє ключову роль у противірусній активності, запобігаючи приєднанню вірусу до біомембрани клітини-мішені.

На культурі людських епітеліальних клітин Hep-2 визначено противірусну активність наносрібла, кон’югованого з ПВП, відносно респіраторно-синцитіального вірусу. Частинки приєднувалися до поверхні вірусу, формуючи упорядковане розміщення та взаємодіючи із G- протеїнами капсиду, що призводило до зниження активності вірусу на 44%. При дослідженні цитотоксичності отриманих наночастинок срібла встановлено, що покриття наносрібла біосумісною сполукою (ПВП) забезпечувало «маскування» поверхні чистого срібла, тим самим знижуючи токсичність без втрати ефективності.

Також визначена противірусна активність різних типів наночастинок срібла щодо вірусу віспи мавп за допомогою реакції пригнічення бляшкоутворення. Серед досліджених наноструктур — наносрібло без покриття розмірами 25; 55 та 80 нм, а також наночастинки цього металу з полісахаридною оболонкою розмірами 10; 25 та 80 нм. Виявилося, що наночастинки срібла розмірами 25 нм із покриттям та 55 нм без покриття мали виражену дозозалежну інгібуючу дію на формування бляшок вірусу віспи мавп. Вчені дійшли до висновку, що наносрібло здатне запобігати проникненню вірусу у клітину шляхом блокування процесу приєднання до біомембрани або переривати внутрішньоклітинну реплікацію вірусу.

Нещодавно проведено дослідження, в якому наночастинки срібла розміром 25 нм сприяли пригніченню процесу потрапляння вірусу вісповакцини у клітину в нецитотоксичних концентраціях. Нано­срібло запобігало як безпосередньому проникненню, так і залежному від макропіноцитозу входу вірусу у клітину-мішень.

Також отримано дані щодо взаємодії наночастинок срібла з вірусом Такарібе (представником родини Arenaviridae) з метою визначення впливу на реплікацію. Виявилося, що наносрібло здатне інгібувати зазначений аренавірус in vitro, оскільки після обробки наночастинками відзначали суттєве пригнічення продукції вірусної РНК та вивільнення нових віріонів. Згідно з цими результатами, наночастинки срібла ефективно інгібують реплікацію вірусу Такарібе при додаванні у середовище перед інфікуванням або безпосередньо після нього, у нетоксичних концентраціях.

В останні роки зростає зацікавленість вчених у застосуванні продуктів нанотехнологій для очищення води. У цьому аспекті перспективним є використання наночастинок нульвалентного срібла (Ag⁰). Механізми противірусної активності таких наносполук достеменно не відомі. Наночастинки можуть вивільняти іони срібла, що взаємодіють із сульфгідрильними групами протеїнів та порушують реплікацію ДНК. Також наносрібло може впливати напряму — інактивувати віруси, безпосередньо з’єднуючись із ними. Привертають увагу результати дослідження з визначення інактивації наночастинками Ag⁰ бактеріофагу UZ1, виділеного зі стічних вод лікарні, а також мишачого норовірусу типу 1, схожого за будовою на норовіруси людини. За допомогою оригінального методу синтезу із застосуванням мікроорганізму Lactobacillus fermentum були отримані біогенні наночастинки Ag⁰ розміром приблизно 11 нм. Вірицидну активність цих наноструктур порівнювали зі сріблом у іонній формі. Інактивацію вірусів спостерігали при додаванні наносрібла у воду в кінцевій дозі 5,4 мг/л. Іонна форма срібла у такій саме дозі проявляла значно нижчу активність порівняно з наночастинками, що підтвердило існування додаткових механізмів противірусної дії наноструктурованого матеріалу.

Також автори досліджували процес тривалого знезараження води у проточній системі із застосуванням фільтра з біогенними наночастинками. Зазвичай основними проблемами подібних конструкцій є вимивання наночастинок та вивільнення іонів срібла, особливо через можливий негативний вплив на навколишнє середовище. Із застосуванням біогенних наночастинок Ag⁰ на електропозитивних фільтрах цих проблем вдалося уникнути. У дослідженні, при значенні рН води 6,2, віруси проявляли себе як негативно заряджені частинки та адсорбувалися на електропозитивному фільтрі, де відбувалася їх інактивація під дією наночастинок. Розроблена технологія може стати перспективною альтернативою сучасним системам очищення води.

Отримані в останні роки дані наукових досліджень свідчать про те, що наночастинки срібла мають перспективи застосування у ролі потужних противірусних лікарських засобів із широким спектром дії. Необхідне проведення подальших досліджень щодо визначення механізму дії наносрібла різної природи і структури та встановлення безпеки цього наноматеріалу для людини і навколишнього середо­вища.

На сьогодні також тривають дослідження з визначення противірусної активності та сполук міді різної природи. Відомо, що такі субстанції виявляють виражені біоцидні властивості, їх застосовують у різних галузях медицини як дезінфектанти і лікарські засоби з антибактеріальною та фунгіцидною активністю. Наприкінці ХХ ст. проведено ґрунтовні дослідження щодо встановлення противірусної активності цього металу. Науковці повідомили світовій спільноті про інактивацію таких одно- і дволанцюгових ДНК- та РНК-вірусів, з/без капсиду: бактеріофаги, вірус інфекційного бронхіту, поліовірус, вірус Джунін, ВПГ, ВІЛ-1, вірус Західного Нілу, вірус Коксакі типу В2 та В4, еховірус типу 4, мавпячий ротавірус SA-11, вірус грипу А, риновірус типу 2, вірус жовтої лихоманки, вірус кору, респіраторно-синцитіальний вірус, вірус парагрипу типу 3, вірус Пунта Торо, вірус Печінде, аденовірус типу 1, цитомегаловірус, вірус вісповакцини [8].

Механізм противірусної активності сполук міді остаточно не встановлений. Існують дані, що вірицидна дія цього металу відносно ВІЛ-1 здійснюється шляхом нейтралізації ВІЛ-1-протеази — білка, необхідного для реплікації. Також можливий непрямий токсичний вплив міді, який полягає в окисному ушкодженні генетичного матеріалу мікроорганізму. У високих концентраціях цей метал здатний стимулювати утворення перекису водню, чим зумовлене порушення структури ДНК. Віруси є вкрай чутливими до такого впливу, оскільки для цих організмів не характерний розвиток резистентності до міді, а також через відсутність механізмів репарації ДНК, на відміну від бактерій та грибів.

З огляду на розвиток нанонауки та нанотехнологій увагу фармакологів та лікарів світу привернули, зокрема, наночастинки міді, завдяки вираженій біоактивності та здатності біоцидно впливати на широкий спектр патогенних мікроорганізмів. Протимікробна активність нанорозмірних сполук цього металу зумовлена малим розміром частинок та великими значеннями відношення площі вільної поверхні до об’єму (Рєзніченко Л.С. та співавт., 2012; Ingle A.P. et al., 2014).

Противірусну активність також проявляють нанорозмірні структури інших металів, таких як золото, залізо і титан. Відомо, наприклад, що кон’югація з наночастинками золота може перетворити терапевтично неактивні органічні молекули у високоактивні засоби. Описано зв’язування вкритих амфіфільними лігандами наночастинок золота із глікопротеїном gp120 ВІЛ з подальшим інгібуванням інфекційності вірусу in vitro. Також досліджено аспекти протигрипозної дії функціоналізованого сіаловою кислотою нанозолота різного розміру та показано, що частинки розміром 14 нм здатні інгібувати гемаглютинацію у наномолярних концентраціях [9]

У ДУ «Інститут епідеміології та інфекційних хвороб імені Л.В. Громашевського НАМН України» проведено вивчення противірусної активності наночастинок металів. У ролі досліджуваних субстанцій були розчини наночастинок золота розміром 5 та 12–15 нм, а також наночастинок золота зі сріблом розміром 5 нм. Показано, що ці сполуки ефективно захищали мишей від летальної грипозної інфекції (штам А/FM/1/47(H1N1)) на рівні стандартних протигрипозних лікарських засобів ремантадину та озельтамівіру. Термін життя мишей подовжувався до 4 міс, що свідчило про повне одужання тварин. Гістологічними, морфологічними та денсиметричними методами показано, що субстанції нанозолота, а також наночастинок золота зі сріб­лом розміром 5 нм позитивно впливали на цитоплазму нейронів та альвеоцитів, а також на стан відновлення ядер нейронів. Механізм протигрипозної дії проявлявся на рівні інгібування нейрамінідазної активності. Також у проведених дослідженнях встановлено, що наночастинки золота пригнічували репродукцію ВПГ-1 (штам VC) та сурогатного вірусу гепатиту С — вірусу бичачої вірусної діареї.

Досліджена активність наночастинок золота, вкритих меркаптоетансульфонатом, відносно ВПГ-1 дикого штаму McIntyre. Результати свідчать, що наночастинки інгібують інфекційність вірусу шляхом блокування ранніх стадій реплікації.

Розроблено новий наноматеріал із наночастинок оксиду заліза (Fe₂O₃), осаджених на скловолокні, та досліджено противірусний потенціал останнього відносно фага MS2 та ротавірусу.

У світовій літературі також повідомляється про антигрипозну активність наночастинок діоксиду титану (TiO₂). Так, проведено дослідження, в якому шляхом гідролізу тетрахлориду титану (TiCl₄­) синтезовані наноструктури TiO₂ розміром 4–10 нм, вірицидну дію яких перевіряли на вірусі грипу штаму H3N2, вирощеному у суспензії культури клітин курячих ембріо­нів. Дані електронної мікроскопії показали, що мікроорганізм знищувався наночастинками TiO₂ протягом 30 хв інкубації. Автори зробили припущення, що противірусна дія наноматеріалу може пояснюватися прямим контактом із вірусом та подальшим руйнуванням капсиду.

Висунуто припущення про можливість існування синергізму між наночастинками TiO₂ та сріблом у разі застосування з метою інактивації мікроорганізмів під впливом ультрафіолетового опромінення. Автори проведеного дослідження показали, що модифікування сріблом наночастинок TiO₂ значно посилило фотокаталітичну інактивацію вірусів, перш за все, шляхом інтенсифікації продукції вільних радикалів. Згідно з результатами досліджень, частинки TiO₂ зі сріблом забезпечували знищення фага MS2 протягом 45 с. На думку авторів, це відкриває нові перспективи застосування фотореакторів із подібними наноматеріалами у системах очищення питної води

Отже, вивчення вірицидних властивостей наночастинок металів — актуальне питання медицини, фармакології та фармації. Доцільним є проведення досліджень зі встановлення противірусної активності, зокрема наночастинок срібла і міді, з метою подальшого впровадження цих речовин у клінічну практику як нових лікарських засобів

 

Застосування НЧС

Завдяки своїм унікальним властивостям наночастинки срібла та їх колоїдні розчини можуть бути використані у різних галузях науки, медицини та техніки.

Такі НЧС мають потенційне застосування в аналітичній хімії як зонди в мас- спектрометрії, а також у разі колориметричного визначення молекул білків і ДНК, а їхнє споріднення для зв’язування багатьох біологічних молекул робить їх привабливими для досліджень у сенсорних технологіях. Оскільки застосування НМ надзвичайно актуальне, особливо у поєднанні з біоселективними елементами – ферментами, то перспективним напрямом є розробка технологій одержання біонаноматеріалів з каталітичними властивостями.

Завдяки антисептичним властивостям НЧС можуть бути використані в різних областях техніки, промисловості, косметики, побутової хімії, харчової промисловості, водопідготовки як консерванти, різні функціональні додатки, антисептичні засоби, а також у медицині, ветеринарії, у фармацевтичній галузі - для виготовлення (гідро)гелів, плівок для лікування опіків та ран, композиційних імплантів, мазей, спреїв, просочень для серветок і т.п., які характеризуються високою антисептичною (бактерицидною і фунгіцидною) ефективністю, нетоксичністю, седиментаційною та хімічною стійкістю. [10]

Завдяки своїм оптичним властивостям наночастинки срібла є перспективними для розробки нових та вдосконалення існуючих аналітичних методів та інструментів, що забезпечують потреби сучасної науки. Поверхневий плазмонний резонанс та великий диференціальний переріз розсіювання світла окремих наночастинок роблять їх ідеальними кандидатами для молекулярного маркування та візуалізації біологічних процесів.