Приготовление лизирующего буфера
При приготовлении лиз.буфера тритон добавить в последнюю очередь – осторожно по стенке, чтобы не образовать пузырей, после чего раствор осторожно перемешивается. Свежеприготовленный лизирующий буфер хранить в холодильнике при +4 – +100С не более 3 суток. Если планируется использовать лиз.буфер более чем через 3 суток, буфер замораживают и хранят в морозильнике.
Приготовление Трис-НСl 2 M (pH 7,6)
| Этап | Реактив | Количество |
| I | Трис | 60,55 г. |
| II | Н2О | 150 мл |
| IIIперемешать на магнитной мешалке | ||
| IV | НСl | 30 мл (до получения рН 7,6) |
| V | Н2О | до 250 мл |
Трис-HCl хранить в холодильнике при +4 – +100С.
Приготовление 0,2 М MgCl2
| Реактив | Количество |
| MgCl2 | 1,9 г. |
| Н2О | до 100 мл |
| удельный вес раствора должен быть 1,015 |
Готовый раствор хранить в холодильнике при +4 – +100С.
Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
| Этап | Реагент | Количество |
| I | соль ЭДТА | 186,1 г. |
| II | Н2О | 800 мл |
| IIIперемешать на магнитной мешалке | ||
| IV | NaOH | 20 г. (до рН 8,0) |
| Vстерилизовать автоклавированием | ||
| VIхранить в холодильнике |
Готовый раствор хранить в холодильнике при +4 – +100С.
Приготовление Soline (ЭДТА)
| Реагент | Количество |
| ЭДТА 0,5 М (рН 8,0) | 25 мл |
| NaCl 5 М | 7,12 мл |
| Н2О | до 500 мл |
Готовый буферный раствор хранить в холодильнике при +4 – +100С. Не замораживать!
Для Soline ЭДТА используется 5М раствор NaCl, техника приготовления которого представлена в таблице 7. Готовый раствор хранить в холодильнике.
Приготовление 5 М NaCl
| Этап | Реагент | Количество |
| I | сухой NaCl | 29,22 г. |
| II | Н2О | 80 мл |
| IIIперемешать на магнитной мешалке | ||
| IV | Н2О | до 1000 мл |
Готовый раствор хранить в холодильнике при +4 – +100С.
Приготовление 10% SDS (додецил сульфат натрия)
| Этап | Реагент | Количество |
| I | SDS (сухой) | 25 г. |
| II | Н2О | 200 мл |
| IIIперемешать на магнитной мешалке | ||
| IIIнагреть в бане до 680С | ||
| IV | НСl | несколько капель – до получение рН 7,2 |
| V | Н2О | до 250 мл |
рН готового раствора Soline EDTA определить при помощи лакмусовой бумаги (светло-зеленый цвет).
Приготовление фенола
| Этап | Реагент | Количество |
| IРасплавить твердый фенол при 680 в водяной бане | ||
| II | 8-оксихинолин | до конечной концентрации 0,1% (антиоксидант) |
| III | Буфер (Трис-HCl pH 8,0 в смеси 0,2% 6-меркаптоэтанола) | насыщают равным объемом до рН 7,6 |
| IVХранить не более 1 месяца при t = +40C |
Готовый забуференный фенол должен четко разделяться на два слоя. Для очистки ДНК пипеткой осторожно набирать нижний слой.
Приложение 2
Возможные проблемы при постановке ПЦР и способы их решения
| Проблема | Возможная причина | Возможные способы решения |
| Шмер по дорожке с гелем | 1.Деградирует продукт 2. Неспецифичная амплификация 3. Избыток ДНК-матрицы | 1. Найдите источник загрязнения нуклеазами; убедитесь, что материал не хранился долго и повторите ПЦР; 2. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции; 3.Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы. |
| Не специфические полосы по дорожке на геле | 1. Неспецифическая амплификация 2. Избыток ДНК-матрицы | 1. Подберите более специфичные праймеры или более оптимальные условия реакции; 2. Возьмите меньшие количества ДНК-матрицы. |
| Полоса продукта слабая или отсутствует | 1. Слабо покрашен гель 2. Отсутствует ДНК-матрица в пробе 3. Деградировали праймеры 4. Праймеры не отжигаются на ДНК-матрице 5. Неправильные условия проведения ПЦР 6. Вышел из строя амплификатор. | 1. Добавьте в агарозу больше бромистого этидия; 2. Добавьте ДНК-матрицу 3. Синтезируйте новые праймеры; 4. Подберите более специфичные праймеры; 5. Подберите более оптимальные условия ПЦР; 6. Замените амплификатор |
Приложение 3
Компоненты и реактивы для прведения электрофореза ДНК