Бактериофаги. Меры борьбы с бактериофагией.

Представляют собой разнообразно устроенные ДНК- или РНК-содержащие вирусы, являющиеся внутриклеточными паразитами бактерий. Они вызывают лизис (растворение) бактерий, используемых при производстве молочных продуктов, в результате чего увеличиваются сроки выработки продукта, ухудшается его качество.

При производстве кисломолочных продуктов наибольшее значение имеют фаги, поражающие мезофильные молочнокислые стрептококки: Lac. lactis, Lac. diacetylactis, Lac. cremoris. Обнаружены бактериофаги, поражающие Str. thermophilus и молочнокислые палочки. Однако среди этих микроорганизмов бактериофаги встречаются очень редко.

Цикл развития бактериофагов показан на рисунке 1. При попадании фаговой частицы в культуру бактерий она адсорбируется на бактериальной клетке и при помощи протеолитического фермента разрыхляет клеточную стенку. Затем белковая оболочка фага сокращается и ДНК впрыскивается в цитоплазму бактериальной клетки. В клетке начинается синтез ДНК фага и его белка. Одновременно подавляется бактериальная генетическая система. В дальнейшем образуются вегетативные фаговые частицы, а через 30-60 мин стенка бактериальной клетки набухает и прорывается, при этом освобождается до 100 новых частиц, которые могут инфицировать 100 новых бактериальных клеток. Так продолжается до тех пор, пока не лизируются все чувствительные клетки бактерий.

Благоприятные условия для размножения фагов находятся в диапазоне температур от 8 до 46 °С. Основными условиями, способствующими размножению бактериофага, являются непрерывное ведение технологического процесса, кислая реакция среды, добавление СаС1_2, разбрызгивание сыворотки, перемешивание.

Основными условиями, подавляющими развитие бактериофага, служат внесение в молоко сычужного фермента, обработка оборудования УФ-лучами, раствором хлорной извести или другими моюще-дезинфицирующими растворами.

Различают две разновидности фагов: вирулентные и умеренные. При инфекции вирулентными фагами их цикл размножения завершается лизисом бактериальной клетки и выходом фаговых частиц. Умеренные фаги в бактериальной клетке не размножаются, в виде профагов встраиваются в генетический аппарат клетки, не принося ей вреда. При этом возможно одновременное деление клетки-хозяина и профага.

Рисунок 1 Цикл развития бактериофага:

а - адсорбция бактериофага на поверхности клетки; б - внедрение ДНК фага в цитоплазму клетки; в - синтез ДНК фага и его белка; г - образование новых частиц фага; д - лизис бактериальной клетки и освобождение фаговых частиц

Вновь образовавшиеся клетки бактерий также не лизируются, и это состояние сожительства клетки и профага может сохраняться на протяжении многих поколений бактерий.

Клетки бактерий, а также их культуры, содержащие профаг, называют лизогенными. Профаг в клетке хозяина может погибнуть или под влиянием внешних индуцирующих воздействий может вновь стать вирулентным, способным размножаться.

Лизогенные штаммы молочнокислых бактерий являются основным источником попадания профагов в производственные закваски, которые в дальнейшем размножаются в микрофлоре полуфабрикатов, продуктов, оборудования, молочной сыворотки и др.

Большое практическое значение имеет специфичность фагов, т.е. способность их размножаться в определенных видах бактерий. Такие фаги и клетки бактерий называют гомологичными.

Специфичные бактериофаги могут лизировать один и даже восемь штаммов одного вида микробов. Установлена также различная фагочувствительность штаммов бактерий, которые могут лизироваться одним или несколькими штаммами бактериофагов. В связи с этим в лабораториях, разрабатывающих закваски, определяют наличие бактериофага в молоке и чувствительность заквасочных штаммов к бактериофагу.

Наличие бактериофага в молоке или закваске устанавливают посевом их в стерильное обезжиренное молоко с добавлением раствора метиленового голубого. Если в процессе культивирования после обесцвечивания метиленового голубого через 4-5 ч снова наблюдается посинение молока, то это указывает на наличие бактериофага.

Для проверки штаммов молочнокислых бактерий на чувствительность к бактериофагу исследуемую культуру (0,1 см³) наносят на поверхность пластинчатого агара с гидролизованным молоком и тщательно распределяют ее шпателем по поверхности среды так, чтобы в дальнейшем после термостатирования можно было получить сплошной рост культуры (газон). На заселенную питательную среду микропипеткой наносят в разных местах по 0,01 см³ фильтрата фага и его разведений (до 5-7). Затем чашки термостатируют при температуре 30 °С в течение 17-18 ч, после чего отмечают наличие или отсутствие роста колоний бактерий в месте нанесения капель фильтрата фага.

Если культура чувствительна к фагу, то на месте нанесения капель фильтрата появляются зоны отсутствия роста исследуемой бактериальной культуры - так называемые «негативные» колонии.

Фаги устойчивы к воздействию высоких температур, они выдерживают режимы пастеризации молока при 75 °С в течение 15 с.

Они хорошо переносят замораживание и длительное хранение (годами) при низких температурах в высушенных субстратах. 1%-ный раствор фенола не оказывает на них заметного действия, 1%-ный раствор формалина инактивирует фаг через несколько минут. Фаги обладают высокой чувствительностью к кислотам. Ультрафиолетовые лучи и ионизирующая радиация вызывают их инактивацию, а в более низких дозах — мутации.

Бактериофаги имеют широкое распространение. Их можно встретить в почве, фекалиях и сточных водах. Поэтому первичное загрязнение молока происходит обычно на ферме. Другими источниками загрязнения являются воздух, зараженная фагами вода, а также недостаточно вымытые и продезинфицированные емкости.

Для борьбы с бактериофагами чаще применяют асептическое выращивание заквасок, частую смену штаммов бактерий в закваске, использование питательных сред, тормозящих деятельность фагов, и др.

Асептическое изготовление заквасок предусматривает абсолютную стерильность, достаточно высокое нагревание молока (не меньше 90 °С), самую тщательную мойку и дезинфекцию всех установок для производства заквасок. Закваски необходимо использовать в течение нескольких дней, а затем применять другую закваску с очень похожими свойствами. Для смены необходимо иметь от 3 до 8 заквасок.

Применение питательных сред, подавляющих развитие бактериофага, основано на том, что адсорбция фагов зависит от присутствия кальция. При использовании свободных от кальция питательных сред можно значительно уменьшить адсорбцию бактериофагов на клетках хозяина. Это объясняется тем, что частицы фага и бактерии имеют одинаковый отрицательный электрический заряд и в отсутствие ионов кальция они взаимно отталкиваются, так как ионы Са²⁺ сообщают клетке положительный заряд.

В питательную среду можно добавлять, так называемое, иммунное молоко, т. е. молоко, полученное от коров, иммунизированных бактериофагами, и содержащее специфические противофаговые антитела.

Кроме того, необходимо осуществлять мойку, дезинфекцию и другие санитарно-гигиенические мероприятия, уменьшающие загрязнение производственных помещений и оборудования бактериофагами.