Мета роботи
1) Засвоїти методику підрахунку еритроцитів.
2) Ознайомитись з принципом будови та роботою целоскопа.
Матеріали і обладнання.Дослідна тварина, спирт, ефір, вата, ножиці, ін'єкційна голка, змішувач для еритроцитів, піпетка П'ятницького на 3,98 мл, капілярна піпетка від гемометра Салі, 3%-ний розчин NаСl, флакон з-під пеніциліну, лічильна камера Горяєва, покривні скельця, мікроскоп, целоскоп.
Прилади для розбавлення крові та підрахунку еритроцитів.
Змішувач для еритроцитів являє собою капілярну піпетку з ампулоподібним розширенням, в середині якого знаходиться скляна кулька для перемішування рідини. На змішувач нанесені мітки 0,5, 1 і 101. Піпетка П'ятницького – це товстостінна капілярна трубка з міткою та грушоподібним розширенням. Об'єм піпетки 3,98 мл. Лічильна камера з сіткою Горяєва –це товсте скло з чотирма жолобками, між якими розміщені три прямокутні площини. Середня площина розділена навпіл поперечним жолобком. На кожній половині нанесена сітка Горяєва, середня площина на 0,1 мм нижче бокових. Коли до бокових площин притирають покривне скло, то між ним та сіткою утворюється камера з глибиною 0,1 мм. Сітка Горяєва складається з 225 великих квадратів. З них 100 квадратів розділені на прямокутники, 100 квадратів не розділені і 25 квадратів розділені – кожний на 16 малих. Сторона малого квадрата дорівнює 1/20 мм, площа 1/20´1/20=1/400 мм2. У лабораторних тварин кров беруть з дрібних підшкірних вен вушної раковини.
Хід роботи
Вздовж зовнішнього краю вушної раковини вистригають шерсть, шкіру протирають спиртом, знежирюють ефіром, відшукують вену і проколюють її голкою, попередньо злегка стиснувши судини біля основи вуха, щоб викликати венозну гіперемію.
а) Розбавлення крові в змішувачі.
Першу краплю витирають ваткою, другу – всмоктують в змішувач до мітки 0,5. Потім до мітки 101 набирають 3%-ний розчин NаСl, при цьому кров розводять у 200 разів. Якщо кров набирають до мітки 1, то розводять у 100 разів. Кінці змішувача затискають між великим і середнім пальцями і струшують 2 –3 хвилини для рівномірного перемішування крові з рідиною. На змішувач надівають гумове кільце, яке закриває його вільні кінці.
б) Розбавлення крові за допомогою піпетки П'ятницького.
Піпеткою П'ятницького для еритроцитів насмоктують 3%-ний розчин NaСl до мітки 3,98 мл і виливають у сухий флакон з-під пеніциліну. Капілярною піпеткою від гемометра Салі набирають 0,02 мл крові і видувають її у флакон з 3%-ним розчином NаСl. Флакон закривають пробкою. Отримують розбавлення крові в 200 разів.
в) Заповнення лічильної камери і підрахунок еритроцитів.
До чистої сухої камери притирають покривне скло (до появи райдужних кілець). Перші 3–4 краплі із змішувача видувають на ватку, а наступну краплю наносять на середню площину камери, поряд з покривним склом. У силу капілярності рідина засмоктується під скло. Із флакона, після його струшування, розведену кров наносять піпеткою для очей. Збільшення мікроскопа: об'єктив – 40, окуляр 7х або 10х. Підраховують еритроцити у п'яти великих квадратах (80 малих), розташованих у сітці по діагоналі. В кожному малому квадраті рахують всі еритроцити, розташовані всередині нього, а також на верхній та лівій межі. Еритроцити на нижній та правій межі не враховують.
Визначення кількості еритроцитів в 1 мкл крові проводять за формулою:
,
де а – кількість підрахованих еритроцитів; с – розведення; n – число квадратів, у яких підраховані еритроцити; h – глибина камери; s – площа кожного квадрату.
РОБОТА 7.3. ПІДРАХУНОК КІЛЬКОСТІ ЛЕЙКОЦИТІВ
Лейкоцити, або білі кров’яні тільця, відіграють важливу роль у захисних та відновних процесах в організмі. Вони виконують функції фагоцитозу, утворення антитіл, знешкодження та видалення токсинів. Лейкоцити за розмірами більші від еритроцитів (їх діаметр 10–20 мк). Вони мають різні форми ядер та неоднорідну протоплазму. Кількість лейкоцитів коливається у великих межах і залежить від виду та віку тварини, від годівлі, роботи, вагітності, лактації, патологічного стану організму і т. д. Збільшення числа лейкоцитів називається лейкоцитозом,а зменшення – лейкопенією.Для розведення крові при підрахунку лейкоцитів використовують розчин оцтової кислоти (руйнує еритроцити), підфарбований метиленовою синькою (фарбує оболонку лейкоцитів).
Контрольні питання.
1. Функції лейкоцитів.
2. Методика підрахунку лейкоцитів.
3. Кількість лейкоцитів у різних тварин.
4. Класифікація лейкоцитів.
Мета роботи.Оволодіти методикою підрахунку лейкоцитів.
Матеріали і обладнання.Змішувач для лейкоцитів, піпетка П'ятницького на 0,38 мл, капілярна піпетка від гемометра, флакон з-під пеніциліну, лічильна камера Горяєва, мікроскоп, 3%-ний розчин оцтової кислоти, підфарбований метиленовою синькою, вата, спирт, голка для взяття крові, дослідна тварина.
Змішувач для лейкоцитівмає менший об'єм ампулоподібного розширення, ніж змішувач для еритроцитів. На капілярну частину його нанесено поділки 0,5 та 1, а вище ампулоподібного розширення –11. При підрахунку лейкоцитів кров набирають до поділки 0,5 або 1. Потім всмоктують до мітки 11 розчинник (3%-ний розчин оцтової кислоти) і перемішують. Кров розводиться в змішувачі відповідно в 10 чи 20 разів.
Хід роботи
Розведення крові за П'ятницьким.
У піпетку П'ятницького на 0,38 мл насмоктують 3 %-ний розчин оцтової кислоти, виливають в сухий флакон і закривають пробкою. Капілярною піпеткою від гемометра, зволоженою 3%-ним розчином лимонно-кислого натрію, набирають 0,02 мл крові, переносять у флакон з розчинником. При цьому кров розводиться в 20 разів.
Заповнення камери для підрахунку лейкоцитів проводиться в тій же послідовності, що й для підрахунку еритроцитів.
Підрахунок лейкоцитів у лічильній камері з сіткою Горяєва проводять у 100 великих неподілених квадратах, зібраних у групи по 4. Кількість лейкоцитів в 1 мкл крові визначають за допомогою тієї ж формули, що і кількість еритроцитів.
РОБОТА 7.4. ВИЗНАЧЕННЯ КІЛЬКОСТІ ГЕМОГЛОБІНУ
Гемоглобін (Нв) –основна складова частина еритроцитів. За хімічною структурою він відноситься до хромопротеїдів і складається з білкової частини –глобіну і простетичної групи – гема, що містить залізо. Утворюючи з киснем нестійку і легкодисоціюючу сполуку – оксигемоглобін, гемоглобін є основним носієм кисню в тканинах. Біосинтез гемоглобіну відбувається в червоному кістковому мозку, частково в печінці та селезінці. В крові ембріонів і у молодих тварин міститься поряд з гемоглобіном дорослих і так званий фетальний гемоглобін. Кількість гемоглобіну залежить від виду, віку, статі і стану тварин. Основним методом визначення гемоглобіну є калориметричний. Кількість гемоглобіну вимірюється в г/л або одиницях Салі.
Контрольні питання.
1. Гемоглобін і його будова.
2. Сполуки гемоглобіну з газами, види та типи гемоглобіну.
3. Методи визначення гемоглобіну.
4. Кількість гемоглобіну в різних видів тварин.
Мета роботи.Ознайомитися з калориметричним і фотометричним методами визначення вмісту гемоглобіну в крові тварин.
Матеріали і обладнання.Гемометр, капілярна піпетка на 20 мкл, 0,02 мл крові, піпетка для води, скляна паличка, децинормальний розчин НСl, дистильована вода, спирт, вата, флакон з-під пеніциліну, гемолізуюча рідина (0,04%-ний розчин аміаку або децинормальний розчин НСl), яка готується розведенням 1,6 мл 25%-ного (питома вага 0,91) розчину аміаку дистильованою водою до 1000 мл, електрофотокалориметр, фотоелектричний еритрогемометр.
Хід роботи
а) Визначення кількості гемоглобіну за методом Салі.
Гемометр ГС-3 складається із штатива з трьома гніздами. Задня стінка штатива являє собою пластинку з матового скла. В бокові гнізда вставлені однакові запаяні пробірки (кольорові стандарти). В середне гніздо вставлена градуйована пробірка для досліджуваної крові. На пробірку нанесена шкала, яка показує кількість гемоглобіну.
У градуйовану пробірку наливають децинормальний розчин НСl до нижньої колової позначки (0,2 мл). В капілярну піпетку набирають 0,02 мл крові. Кров, яка ще залишилась на кінчику капіляра, видаляють ваткою. Опускають капіляр на дно градуйованої пробірки і обережно видувають із нього кров так, щоб верхній шар розчину залишався прозорим. Потім два–три рази обережно промивають капіляр, набираючи розчин із верхнього прозорого шару. Виймають капіляр із пробірки, ретельно перемішують її вміст скляною паличкою і ставлять в штатив. Через 5 хв до розчину по краплях додають дистильовану воду і перемішують скляною паличкою до отримання однакового забарвлення зі стандартом. Поділка на шкалі, до якої піднялась рідина, покаже кількість гемоглобіну в грамах на 100 або 100 мл крові.
б) Визначення кількості гемоглобіну за допомогою фотоелектрокалориметра.
Відмірюють 4 мл 0,04 %-ного розчину аміаку в пеніциліновий флакон, потім піпеткою від гемометра беруть 20 мкл крові і виливають в цей розчин. Одержану пробу досліджують за допомогою ФЕК-М при зеленому світлофільтрі в кюветі шириною 10 мм. Контролем є дистильована вода. За оптичною густиною, за допомогою спеціальної таблиці визначають кількість (г/л) гемоглобіну в досліджуваній крові.
в) Визначення кількості гемоглобіну за допомогою фотоелектричного еритрогемометра 0,65.
У пробірку або стаканчик наливають 6 мл 0,04 %-ного розчину аміаку і за допомогою капілярної піпетки вносять 0,04 мл крові (розведення 1:150). Вміст перемішують, виливають в кювету «Г» і поміщають її в прилад на місце установчого світлофільтру «У». Натискають кнопку і обертанням ручки відрахункового диску повертають відхилену стрілку мікроамперметра в нульове положення. На шкалі гемоглобінометра читають результат в г/л.
РОБОТА 7.5. ВИЗНАЧЕННЯ ГРУП КРОВІ I РЕЗУС-ФАКТОРА
В основі поділу крові на групи лежать внутрішньовидові біологічні її відмінності, що проявляється наявністю у різних особин специфічних білків – аглютиногенів на поверхні еритроцитів і аглютинінів у плазмі. Існує два види аглютиногенів (А і В) і відповідно два види аглютинінів (α і b).
В межах одної групи крові однойменні аглютиніни і аглютиногени (А і α, В і b) не зустрічаються, тому еритроцити не склеюються в грудочки. Склеювання еритроцитів в грудочки (аглютинація) настає лише при змішуванні однойменних аглютинінів і аглютиногенів, що можливо при переливанні несумісної крові.
У людей існує чотири комбінації аглютиногенів і аглютинінів системи АВО. У тварини виявлено велику кількість антигенних факторів в еритроцитах і майже повна відсутність або нерегулярна наявність природних антитіл у сироватці.
В 1940 р. К. Ландштейнер і І. Віннер встановили наявність в еритроцитах людини ще одного аглютиногена, який був знайдений в крові мавпи (макака-резус) і тому був названий резус-фактором. Реціпієнтам з резус-негативною кров'ю необхідно переливати тільки резус-негативну, а з резус-позитивною – тільки резус-позитивну кров.
Контрольні питання.
1. Резус-фактор і його значення при переливанні крові.
2. Суть методики визначення резус-фактора в еритроцитах.
3. Характеристика груп крові у людини.
4. Кількість і особливості груп крові у тварин.
Мета роботи. Ознайомитись з методикою визначення груп крові і резус-фактора у людини та визначити свою групу крові.
Матеріали і обладнання. Скарифікатори, предметне скло, восковий олівець, скляні палички, піпетки для очей, стандартні сироватки I, II, III груп, фізіологічний розчин, спирт, ефір, вата, лінзи, стандартні антирезусні сироватки всіх груп крові, чашки Петрі, водяна баня, ватні кульки.
Хід роботи
а) Визначення груп крові.
Для визначення груп крові використовують цоліклони анти-А і анти-В стандартних ізогемаглютинуючих сироваток. цоліклони анти-А і анти-В представляють собою розведену асцитну рідину мишей носіїв відповідної гібрідоми в якій міститяться специфічні імуноглобуліни класу М, які направлені проти групоспецифічних антигенів В і В людини.
Техніка визначення.
Восковим олівцем на предметному склі роблять мітки анти-А і анти-В. З протилежного боку скла наносять по одній великі краплі відповідного цоліклону.
У досліджуваного протирають подушечку пальця спиртом, потім ефіром, проколюють шкіру скарифікатором. Окремими скляними паличками наносять по краплі крові і перемішують їх сухою скляною паличкою, яку витирають при роботі з кожною краплею крові. Читають результати аглютинації і роблять висновки про групу досліджуваної крові.
б) Дослідження крові на вміст в еритроцитах резус-фактора експрес-методом Т.Г. Соловйової.
Для визначення резус-фактора використовують моноклональні антитіла анти-Д СУПЕР. Діючим початком моноклональних антитіл анти-Д СУПЕР є моноклональні людські антитіла, які продукуються гетерогібридомою внаслідок злиття лімфобластичної лінії людини з мієломною клітиною лінією мишей.
Техніка визначення. На предметне скло наносять велику краплю (біля 0,1 мл) реагенту. Поруч розташовують невелику краплю крові, що досліджується і перемішують її з реагентом. Реакція аглютинації починає розвиватися через 10 сек, чітко проявляється через 30-60 сек. результати реакції читають через 3 хвилини.
VIII. ФІЗІОЛОГІЯ СЕРЦЯ ТА СУДИН
Серце вищих тварин є порожнистим м'язовим органом, який складається з 4-х камер: двох передсердь і двох шлуночків. Для серцевого м'яза характерні такі властивості: збудливість, автоматія, здатність проводити збудження, скоротливість, рефрактерність. Скорочення м'яза серця підпорядковуються дії закону “все або нічого”. Скорочення серцевого м'яза називають систолою, а розслаблення – діастолою. Діяльність серця регулюється нервовою системою і гуморальними факторами. Центр, який регулює діяльність серця, знаходиться в довгастому мозку. По симпатичних і блукаючих нервах він посилає до серця імпульси, які посилюють або послаблюють його діяльність.
У ссавців і птахів кров безперервно рухається по кровоносних судинах, які являють собою замкнену систему трубок. Цей рух крові забезпечується роботою серця. Всю кровоносну систему розділяють на два кола кровообігу – велике і мале. Рух крові по кровоносних судинах підпорядковується дії закону руху рідини по системі трубок, тобто законам гідродинаміки. Регуляція кровообігу пов'язана зі зміною діаметра судин. Просвіт кровоносних судин регулюється нервовою системою, яка підтримує гладеньку мускулатуру стінок судин у стані невеликої тривалої напруги, при якій не розвивається втома.
РОБОТА 8.1. ВИВЧЕННЯ ДІЯЛЬНОСТІ СЕРЦЯ
Цикл серцевої діяльності теплокровних тварин складається з трьох взаємопов'язаних фаз: систоли передсердь, систоли шлуночків і загальної діастоли. У жаби серце складається з трьох камер (венозний синус, два передсердя і один шлуночок). Цикл починається з систоли венозного синуса, систоли передсердь, систоли шлуночка та загальної діастоли. Ці фази складають один серцевий цикл. Місцеве подразнення венозного синуса теплом призводить до збільшення, а холодом – до зменшення частоти серцевих скорочень.
Контрольні питання.
1. Методи вивчення серцевої діяльності.
2. Серцевий цикл.
3. Провідна система серця, її будова і розміщення у ссавців, амфібій.
4. Автоматія серця.
5. Теорії автоматії серця.
6. Швидкість проведення збудження в провідній системі серця.