Одномерная радиальная иммунодиффузия в агаровом геле для определения иммуноглобулинов
Принцип.
Антиген, внесенный в лунку агарового слоя, содержащего специфические антитела, диффундируя в агаре, образует кольцо преципитации. Диаметр колец увеличивается до тех пор, пока весь внесенный в лунку антиген не будет связан содержащимися в геле антителами. Величина преципитата отражает количество антител в геле, эквивалентное концентрации антигена, внесенного в лунку. Площадь преципитата, или квадрат диаметра кольца, прямо пропорциональна количеству внесенного в лунку антигена и обратно пропорциональна концентрации антител в агаре. При этом между концентрацией испытуемого антигена и площадью преципитата имеется линейная зависимость. Как показали исследования Mancini и соавт., прямая пропорциональность между площадью преципитата (или квадратом диаметра) и концентрацией антигена устанавливается лишь после прекращения роста колец. Это время различно для разных антигенов и зависит от их молекулярной массы. Так, при одной и той же концентрации рост колец преципитации прекращается для белков Бенс-Джонса через 24 ч, IgG — через неделю, a IgM — через 10 дней.
Уже через 1 ч после начала диффузии можно получить линейную зависимость между диаметром колец преципитации и логарифмом концентрации. Fahey и McKelvey (1965) предложили односуточную инкубацию. В этом случае линейная зависимость устанавливается лишь в небольшом диапазоне концентраций.
Однако использование односуточной инкубации более удобно в практической работе. Поэтому все дальнейшее описание метода радиальной иммунодиффузии относится к этому варианту.
Приборы и оборудование.
1. Стекла 9 X 12 см.
2. П-образная рамка 120Х90Х X 8 мм и толщиной 1 мм для облегчения заливки стекла агаром (при определенном навыке агар можно заливать непосредственно на стекло).
3. Водяная баня на 50—60 °С.
4. Автоматическая пипетка вместимостью 2 мкл или пастеровские пипетки с оттянутым концом.
5. Влажная камера.
6. Измеритель.
7. Миллиметровая линейка.
Реактивы.
1. Моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам А, М и G.
2. 3 % агар, предварительно очищенный в 0,2 М вероналовом буфере, рН 8,56. Навеску 3 г сухого очищенного агара заливают 50 мл дистиллированной воды и ставят на небольшой огонь, постоянно помешивая в течение 40 мин, затем добавляют 50 мл 0,2 М вероналового буфера рН 8,56 и доводят на огне до полного растворения агара (не доводить до кипения!). Добавляют 2 мл 1 % раствора мертиолата.
3. Вероналовый буфер 0,2 М, рН 8,56 (5,52 г веронала растворяют в 300 мл дистиллированной воды, постоянно перемешивая при нагревании, добавляют 35,04 г мединала; дистиллированную воду добавляют до 1 л при охлаждении раствора до 20 °С).
4. Окрашивающая жидкость: амидо-черный — 1 г, ледяная уксусная кислота — 100 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл. Профильтровать. 5. Отмывающая жидкость: ледяная уксусная кислота — 70 мл, дистиллированная вода — до 1000 мл.
Ход определения.
Техника постановки опыта.
Титрование антисыворотки и выбор рабочего разведения. Берут две стеклянные пластины 9 Х 12 см, одна из которых смазана гидрофобной жидкостью (например, ГКЖ-94), другая — тонким слоем агара (каплю горячего агара растирают на пластине пипеткой, а пластину прогревают над пламенем). Между этими пластинами устанавливают П-образную рамку толщиной 1 мм и всю систему скрепляют зажимами. Готовят ряд разведении антисывороток на 0,1 М веронал-мединаловом буфере, рН 8,6. Так, для исследования сывороточных иммуноглобулинов разведения выпускаемых в настоящее время антисывороток могут колебаться от 1/10 до 1/60.
Пробирки, содержащие по 1 мл каждого разведения антисыворотки, помещают в водяную баню при 56 °С и добавляют в них по 1 мл растопленного и охлажденного до 56 °С 3 % агара. Смесь агара и антисыворотки хорошо перемешивают и быстро выливают в пространство между пластинами, держа последние под углом так, чтобы в них не попали пузырьки воздуха. Начинают с большего разведения антисыворотки, добавляя каждое последующее разведение после застывания предыдущего. На пластине можно разместить 4 ряда смеси агара с антисывороткой в объеме 2 мл каждое. После застывания последнего ряда агара снимают зажимы, рамку и пластинку, смазанную гидрофобной жидкостью. В каждом ряду, соответствующем разведению антисыворотки, пробойником делают лунки, куда с помощью микрошприца добавляют разведения стандартного препарата в объеме 2 мил. Через сутки инкубации при 4 °С оценивают результаты. Рабочим разведением антисыворотки для каждой системы (для исследования сывороток, секретов и др.) нужно считать максимальное разведение антисыворотки, дающее со стандартом четкие кольца преципитации, интенсивность которых достаточна для их измерения.
Количественное определение иммуноглобулинов в испытуемых препаратах.
Растопленный и нагретый до 56 °С 3 % агар в объеме 4 мл смешивают с равным объемом антисыворотки, разведенной веронал-мединаловым буфером 0,1 М до 1/2 рабочего разведения. Эту смесь в объеме 8 мл заливают в пространство между двумя пластинами, как описано выше (см. <Титрование антисывороток»). Пластины с залитой смесью оставляют на 10 мин при комнатной температуре. После застывания смеси агара с антисывороткой снимают зажимы, рамку и пластину, смазанную гидрофобной жидкостью. На каждой пластине пробойником делают 35 лунок диаметром 2 мм
Приведена концентрация, пригодная для большинства серий агара. Для разных серий необходимая концентрация агара устанавливается эмпирически.
на расстоянии 15 мм друг от друга. Для того чтобы предотвратить деформацию периферических колец, особенно IgM, за счет подсыхания агара и появления эндоосмотических потоков делают по периметру агара дополнительные лунки. Готовят разведения стандарта, меняя пипетки после каждого разведения. Для исследования сывороточных иммуноглобулинов используют стандартную сыворотку (см. ниже), неразведенную и разведенную до 1:2—1:8. В лунки микрошприцем вносят по 2 мкл каждого разведения и испытуемых препаратов. Пластины помещают во влажную камеру и инкубируют сутки при 4 °С. Через 24 ч (ровно!) пластины погружают в забуференный изотонический раствор натрия хлорида и отмывают от несвязавшихся белков в течение 2 сут с троекратной сменой буфера. Затем пластины сушат под фильтровальной бумагой и окрашивают амидо-черным. Учет результатов возможен в неокрашенных пластинах на темном поле с косым освещением, при этом используют для измерения препаратоводитель с нониусом, позволяющим измерять диаметр с точностью до 0,1 мм.
Определив диаметр колец преципитации в стандартном препарате с известным уровнем иммуноглобулинов, строят кривую на полулогарифмической бумаге, где на оси ординат откладывают концентрацию иммуноглобулинов, а на оси абсцисс — диаметр колец. Такую кривую строят для каждой пластины. Далее, измерив диаметр колец в испытуемом препарате, определяют по стандартной кривой концентрацию иммуноглобулинов в этом препарате.
В основе реакций преципитации лежит образование и выпадение в осадок комплексов антиген-антитело. В реакции участвуют растворимые антигены: преципитиногены (продукты микроорганизмов, тканей, химические вещества и лекарства). Антитела (преципитины), соединяясь с растворимыми антигенами, вызывают их агрегацию, что проявляется в помутнении прозрачных жидкостей или выпадении осадка (преципитата). Диагностические преципитирующие сыворотки выпускают с высоким титром антител. Их получают путем иммунизации лабораторных животных соответствующим антигеном. Титром преципитирующей сыворотки является минимальное количество антигена, которое данная сыворотка может преципитировать.
Реакцию преципитации можно проводить в жидкой и плотной среде (в агаре или геле).
Реакция преципитации в жидкой среде (кольцепреципитация). Реакцию ставят в узких пробирках, куда вносят преципитирующую антисыворотку, а сверху осторожно наслаивают прозрачный раствор антигена. При положительной реакции через несколько минут на границе соприкосновения двух жидкостей появится кольцо преципитации. При малых количествах реагентов реакцию можно проводить в капиллярах (микропреципитация).
Реакция преципитации в агаре. Сущность реакции в том, что антигены и антитела, помещенные в разные лунки в агаре, диффундируют навстречу друг другу и при взаимодействии образуют комплекс, который осаждается в виде линии преципитации.
Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони. Реакцию проводят на пластинках с агаровым гелем. Растворы антигена и антисыворотки помещают в лунки, вырезанные на некотором расстоянии друг от друга. Иммунореагенты диффундируют в геле, при встрече образуют комплексы, которые осаждаются в виде линий преципитации. Этот метод позволяет исследовать сразу несколько образцов иммунореагентов. Например, вокруг лунки с антисывороткой можно разместить несколько лунок с растворами разных антигенов или наоборот.
Метод определения токсигенности микробов в реакции преципитации. Принцип иммунодиффузии в геле положен в основу метода, который применяется для изучения токсигенности (способности вырабатывать токсин) бактерий. Например, для обнаружения дифтерийного токсина на чашку Петри с агаром посередине накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксической сывороткой. Рядом засевают исследуемые культуры бактерий. Если они выделяют токсин, то при взаимодействии с антитоксинами между колониями и полоской бумаги образуются линии преципитации.
Иммунодиффузия в геле лежит в основе реакции преципитации по Манчини, которая используется для определения классов иммуноглобулинов в сыворотке крови (см. иммуноглобулины).
Реакции преципитации используются для; определения антигенов бактерий, тканей человека и животных; диагностики некоторых инфекционных заболеваний; определения видовой принадлежности белка в судебной медицине; выявления примесей в мясных, рыбных, мучных изделиях в санитарной практике.
В РСК помимо антигена и антител принимает участие третий компонент - комплемент, который способен связываться с комплексом антиген-антитело. РСК позволяет выявлять антигены при наличии к ним антисывороток или антитела с помощью антигенов-диагностикумов.
Образование комплексов антиген-антитело и фиксация комплемента не сопровождаются видимыми изменениями. Для обнаружения связывания комплемента используют дополнительную индикаторную гемолитическую систему. Эта система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической антисывороткой. В присутствии комплемента (сыворотки морской свинки) происходит лизис эритроцитов.
Принцип метода состоит в том, что если в опытной системе образовался комплекс антиген-антитело, который связал комплемент, то не будет лизиса эритроцитов в индикаторной гемолитической системе (РСК положительная, выявлен антиген или антитело). Если в опытной системе комплекс антиген-антитело не формируется, комплемент остается свободным, взаимодействует с гемолитической системой и вызывает лизис эритроцитов (РСК отрицательная, есть гемолиз). РСК лежит в основе реакции Вассермана, которая применяется для диагностики сифилиса.
41. Серологические реакции, происходящие с участием комплемента: реакции
иммунного лизиса (бактериолиз, гемолиз), реакции иммобилизации
микроорганизмов, реакция связывания комплемента (FCK). Ингредиенты для
постановки РСК. Схема проведения и учет. Использование в диагностике
инфекционных заболеваний.
Реакция связывания комплемента (РСК). Предложена Ж. Бордэ и О. Жангу в 1901 г. и, несмотря на столь длительное применение в лабораторной практике, не утратила своего значения по настоящее время. Более того, диапазон ее применения значительно расширился по мере открытия ранее неизвестных возбудителей новых инфекционных заболеваний: бактерий, микоплазм, вирусов, грибов и других патогенов. Данная реакция используется для серодиагностики и обнаружения антигена в исследуемом материале, сероидентификации выделен ных культур. Она характеризуется высокой чувствительностью и достаточной специфичностью, а также возможностью применения как корпускулярных, так и растворимых антигенов. Последнее связано с тем, что комплемент связывается с Fc-фрагментом антител независимо от их специфичности. Таким образом, способность комплемента связываться только с комплексом антиген - антитело за счет Fc-фрагментов последнего и не вызывать гемолиз сенсибилизированных эритроцитов (тест-система) послужила основой для широкого применения РСК в лабораторной практике в течение прошедшего столетия. Для постановки РСК требуется предварительная подготовка ингредиентов реакции, особенно комплемента, в качестве которого используют сыворотку крови морской свинки с установкой рабочей дозы. Однако за последние десятилетия выпускается сухой оттитрованный комплемент, что значительно облегчило постановку реакции. Исследуемые сыворотки крови и антигены обязательно контролируются на антикомплементарность. Постановку основного опыта производят в пробирках путем внесения в нее определенных объемов сыворотки крови, антигена и рабочей дозы комплемента. Смесь инкубируют в термостате при 37°С в течение часа. Регистрацию результатов реакции проводят по гемолизу сенсибилизированных эритроцитов барана. Их приготавливают при смешивании гемолитической сыворотки кролика с эритроцитами барана. При внесении комплемента в эту смесь происходит реакция гемолиза. Таким образом, в тех случаях, когда комплемент не связывается с исследуемой системой антиген - антитело, т.е. остается свободным, наблюдается полный гемолиз бараньих эритроцитов, который свидетельствует об отрицательной реакции. Отсутствие гемолиза указывает на связывание комплемента системой антиген - антитело, т.е. на положительную реакцию, которая обозначается крестами. Интенсивность задержки гемолиза оценивается по четырехкрестной системе, при этом полное отсутствие гемолиза обозначается ++++. Реакция иммунного лизиса. В основе реакции лежит способность специфических антител образовывать иммунные комплексы с клетками, в том числе с эритроцитами, бактериями, что приводит к активации системы комплемента по классическому пути и лизису клеток. Из реакций иммунного лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и редко - реакция бактериолиза (главным образом при дифференциации Холерных и холероподобных вибрионов). Реакция гемолиза. Под влиянием реакции с антителами в присутствии комплемента мутная взвесь эритроцитов превращается в ярко-красную прозрачную жидкость - «лаковую кровь» вследствие выхода гемоглобина. При постановке диагностической реакции связывания комплемента (РСК) реакция гемолиза используется как индикаторная: для тестирования присутствия или отсутствия (связывания) свободного комплемента. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) является одним из вариантов реакции гемолиза. Она позволяет определить число антителообразующих клеток. Количество клеток, секретирую-щих антитела - гемолизины, определяют по числу бляшек гемолиза, возникающих в агаровом геле, содержащем эритроциты, суспензию клеток исследуемой лимфоидной ткани и комплемент. Реакция иммобилизации. Способность антисыворотки вызывать иммобилизацию подвижных микроорганизмов связана с реакцией между микробными антигенами и специфическими антителами в присутствии комплемента. Иммобилизующие антитела обнаружены при сифилисе, холере и некоторых других инфекционных заболеваниях, возбудители которых являются подвижными микроорганизмами.
42. Серологические реакции е участием меченых антигенов или антител. Принципы постановки и учета РИФ, РИА, ИФА, иммуноблоттинга. Практическое применение.
СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ (лат. serum сыворотка + logos учение) - методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, а также выявления антигенов микробов или тканей с целью их идентификации, основанные на реакциях иммунитета.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) — это метод, с помощью которого можно выявить антитела к известным антигенам. Метод основан на микроскопии окрашенных специальным образом мазков и других образцов тканей. Применяется в основном для обнаружения возбудителей инфекций мочеполовых путей, таких как хламидии, микоплазмы, трихомонады, гонококки, вирус герпеса и пр.
Существует два типа реакции иммунофлюоресценции — прямая и непрямая.
· Прямая иммунофлюоресценция (ПИФ) — в этом случае непосредственно специфическое антитело мечено флюорохромом и реакция проходит в один этап, что значительно сокращает сроки исследования.
· Непрямая иммунофлюоресценция (РНИФ) — в этом случае специфическое антитело не имеет метки, а для выявления комплекса антиген-антитело, образовавшегося на первом этапе, используют вторые меченые антитела, специфичные к конкретным антителам.
Материалом для исследования служат мазки. Техника взятия мазков не представляет опасности для здоровья и является безболезненной. Реакцию оценивают с помощью люминисцентного микроскопа. Если тестируемые возбудители присутствуют, то они светятся, как светлячки в объективе микроскопа.
РАДИОИММУННЫЙ АНАЛИЗ, РИА - метод выявления антигенов и антител, основанный на определении комплекса антиген-антитело за счет введения в один из компонентов реакции радиоактивной метки с последующей ее детекцией. Основой проведения любого варианта РИА служит сравнительное определение единиц счета импульсов, зарегистрированных при исследовании в идентичных условиях стандартных и измеряемых образцов
Иммуноферментный анализ, или ИФА (англ. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) — это лабораторный иммунологический метод качественного определения и количественного измерения антигенов, а также иммуноглобулинов и гормонов. а, который может проводиться в различных вариантах постановки.
Достоинства ИФА — возможность ранней диагностики инфекции, возможность прослеживать динамику развития процесса, быстрота и удобство в работе.
Недостаток ИФА — относясь к непрямым методам диагностики, он позволяет определить иммунный ответ организма на возбудителя, а не сам возбудитель
ИММУНОБЛОТ (western blot) – метод лабораторного исследования сыворотки крови на присутствие антител к ВИЧ; это более точный анализ, чем ИФА, и используется для подтверждения результатов