Розщеплення гідроген пероксиду каталазою крові
Визначення каталазного числа крові.
Завдання 1.Виявити дію каталази.
Хід роботи. У пробірку наливають 10–15 крапель 3% розчину Н2О2 і додають 1 краплю крові. Відбувається бурхливе виділення кисню: рідина піниться, піна заповнює всю пробірку.
Завдання 2.Визначити каталазне число крові.
Принцип. Метод базується на визначенні кількості гідроген пероксиду, розщепленого ферментом за певний проміжок часу. Про кількість розщепленого гідроген пероксиду судять за різницею кількості КМnО4, витраченої на титрування до і після дії каталази:
2КМnО4 + 5Н2О2 + 3Н2SO4 → 5О2 + 2МnSО4 + K2SО4 + 8H2O
Хід роботи. У дві колби для титрування наливають по 1 мл розведеної крові (1:1 000) і підливають по 7 мл Н2О (дист.). Потім у досліджувану пробу додають 2 мл 1% Н2О2, а в контрольну – 5 мл 10% розчину Н2SО4. Дія каталази в кислому середовищі (у контрольній пробі) припиняється, оскільки вона діє при рН=7,4. Обидві проби залишають при кімнатній температурі на 30 хв, потім наливають у досліджувану колбу 5 мл 10% Н2SO4, а в контрольну – 2 мл 1% розчину Н2О2. Вміст кожної колби титрують 0,1 н розчином КМnО4 до слабко рожевого забарвлення. Розраховують каталазне число (КЧ) за формулою:
КЧ (од) = (А – В)×1,7,
де А – кількість 0,1 н КМnО4, що пішла на титрування контрольної проби, мл; В – кількість 0,1 н КМnО4, що пішла на титрування досліджуваної проби, мл; 1,7 – кількість Н2О2, яка еквівалентна 1 мл 0,1 н КМnО4, мг (1 мл 0,1 н КМnО4 еквівалентний до 1 мл 0,1 н Н2О2).
Клініко-діагностичне значення.Каталаза (КФ 1.11.1.6) – геміновий фермент, який розкладає гідроген пероксид на молекулярний кисень і воду. Показником активності каталази є каталазне число – кількість мл гідроген пероксиду, що розкладається одним мікролітром (10-6 л) крові за певний проміжок часу. У нормі каталазне число становить від 10 до 15 одиниць, воно знижується при деяких захворюваннях, які супроводжуються кахексією (рак, анемія, туберкульоз).
ЛІТЕРАТУРА
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія / Ю.І Губський. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 122–136.
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія: підручник / Ю.І. Губський. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 157–174.
3. Гонський Я.І. Біохімія людини: підручник / Я.І. Гонський, Т.П. Максимчук, М.І. Калинський. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 256–286.
4. Біологічна хімія / Л.М. Вороніна та ін. – Харків: Основа, 2000. – С. 172–228.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 305–316.
6. Биохимия: учебник / под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 264–280.
7. Николаев А.Я. Биологическая химия / А.Я. Николаев. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 199–212, 222–231.
8. Практикум з біологічної хімії / Д.П. Бойків, О.Л. Іванків, Л.І. Кобилянська та ін.; за ред. О.Я. Склярова. – К.:Здоров’я,2002. – С. 67–88.
9. Лабораторні та семінарські заняття з біологічної хімії: навч. посібник для студентів вищих навч. закл. / Л.М. Вороніна, В.Ф. Десенко, А.Л. Загайко та ін. – Харків: Вид-во НФаУ; Оригінал, 2004. – С. 107–123.
ЗМІСТКОВИЙ МОДУЛЬ 8
ЗАНЯТТЯ 8 (2години)
Тема: Основні закономірності обміну речовин. Загальні шляхи катаболізму: окисне декарбоксилування пірувату, цикл трикарбонових кислот (цикл Г. Кребса). Визначення активності сукцинатдегідрогенази м’язів.
Актуальність.Окисне декарбоксилування пірувату та цикл трикарбонових кислот (цикл Г. Кребса) є загальними метаболічними процесами, що завершують внутрішньоклітинний розпад білків, жирів та вуглеводів; вони локалізовані у мітохондріях, забезпечують безперебійне доставлення електронів та протонів у дихальний ланцюг. Цикл Г. Кребса виконує інтегративну, воденьгенеруючу, енергетичну та амфіболічну функції. Обмін речовин у живій клітині тісно пов'язаний з обміном енергії. Порушення енергетичного обміну є в більшості випадків важливою ланкою патогенезу різних захворювань, а його корекція складає основу їх профілактики та лікування.
Мета.Вивчити біохімічні закономірності протікання обміну речовин та енергії; окисного декарбоксилування піровіноградної кислоти; функціонування, механізми регуляції та ключову роль циклу трикарбонових кислот в обміні речовин та енергії. Ознайомитися з визначенням активності сукцинатдегідрогенази м’язів та її конкурентного інгібування малоновою кислотою.
ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОСТІЙНОЇ РОБОТИ
ПІД ЧАС ПІДГОТОВКИ ДО ЗАНЯТТЯ
ТЕОРЕТИЧНІ ПИТАННЯ
1. Загальні уявлення про метаболізм та обмін енергії в організмі. Катаболічні та анаболічні шляхи метаболізму, їх взаємозв’язок.
2. Стадії катаболізму для екзогенних та ендогенних біомолекул в організмі. Загальні та специфічні шляхи катаболізму. Кінцеві продукти катаболічних шляхів в організмі людини.
3. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів та метаболічних шляхів, компартменталізація метаболічних процесів у клітині. Методи вивчення обміну речовин.
4. Окисне декарбоксилування пірувату: послідовність реакцій, характеристика піруватдегідрогеназного мультиферментного комплексу.
5. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК, цикл Кребса): внутрішньо-клітинна локалізація і характеристика ферментів, послідовність реакцій, регуляція і біологічна роль. Енергетичний баланс ЦТК.
ТЕСТОВІ ЗАВДАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ
1. Укажіть клітинну локалізацію ферментів циклу Кребса.
| А. Мітохондрії. | С. Ендоплазматичний ретикулум. | Е. Лізосоми. |
| В. Цитоплазма. | D. Ядро. |
2. Цикл трикарбонових кислот – друга назва циклу Кребса. Назвіть трикарбонову кислоту з циклу Кребса.
| А. α-Кетоглутарат. | С. Сукцинат. | Е. Малат. |
| В. Ізоцитрат. | D. Фумарат. |
3. Назвіть продукт першої реакції циклу Кребса.
| А. Цис-аконітат. | С. Цитрат. | Е. Малат. |
| В. Ізоцитрат. | D. α-Кетоглутарат. |
4.Позначте фермент циклу Кребса, активність якого лімітує швидкість протікання всього процесу в цілому.
| А. Цитратсинтаза. | D. Сукциніл-КоА-тіокіназа. |
| В. Сукцинатдегідрогеназа. | Е. Малатдегідрогеназа. |
| С. Ізоцитратдегідрогеназа. |
5. Укажіть фермент циклу Кребса, необхідний для синтезу ГТФ:
| А. Цитратсинтаза. | D. Сукциніл-КоА-тіокіназа. |
| В. Сукцинатдегідрогеназа. | Е. Малатдегідрогеназа. |
| С. Ізоцитратдегідрогеназа. |
6. Назвіть метаболіт циклу Кребса, який є макроергічною речовиною.
| А. Цитрат. | С. Ізоцитрат. | Е. Фумарат. |
| В. Сукцинат. | D. Сукциніл-КоА. |
7. Укажіть енергоефект циклу Кребса (у молях АТФ), який забезпечується процесом окисного фосфорилування у розрахунку на 1 моль ацетил-КоА.
| А. 8 АТФ. | В. 11 АТФ. | С. 12 АТФ. | D. 9 АТФ. | Е. 3 АТФ. |
8. В реакції окисного декарбоксилування пірувату беруть участь усі вітаміни, крім:
| А. В5. | В. В3. | С. В2. | D. В1. | Е. В7. |
9. При тканинному диханні відбувається універсалізація енергії шляхом утворення АТФ. Скільки молекул АТФ утворюється при перетворенні α-кетоглутарату на сукциніл-КоА?
| А. 5. | В. 6. | С. 3. | D. 2. | Е. 12. |
10. Що є загальним проміжним продуктом обміну (білків, ліпідів, вуглеводів)?
| А. Сукциніл-КоА. | С. Оксалацетат. | Е. Цитрат. |
| В. Ацетил-КоА. | D. Лактат. |
ПРАКТИЧНА РОБОТА
Активність сукцинатдегідрогенази м’язів
та її конкурентне інгібування малоновою кислотою
Завдання.Виявити дію сукцинатдегідрогенази м’язів і конкурентне інгібування її активності малоновою кислотою.
Принцип.Про дію сукцинатдегідрогенази (СДГ), яка каталізує окислення (дегідрування) янтарної кислоти (НООС-СН2-СН2-СООН) до фумарової (НООС-СН=СН-СООН), судять за знебарвленням спеціально уведеного в реакційну суміш акцептора водню 2,6-дихлорфеноліндо-фенолу, який відновлюється і переходить у лейкоформу. Знебарвлення реакційної суміші не відбувається за присутності малонової кислоти (НООС-СН2-СООН), яка є конкурентним інгібітором СДГ.
Хід роботи.Для отримання ферментного препарату 1–2 г свіжих м’язів подрібнюють ножицями і розтирають у ступці з невеликою кількістю води (2–3 мл) протягом 1 хв, потім м’язову кашку переносять на подвійний шар марлі у лійці, промивають 25 мл дистильованої води. Промиту кашку віджимають, переносять у пробірку і суспендують скляною паличкою з 4 мл води. Отриману суспензію рівномірно розливають у чотири пробірки. Першу пробірку кип’ятять протягом 1–2 хв для інактивації ферменту, потім у пробірки приливають реактиви за схемою, наведеною у таблиці:
| № пробірки | Сукцинат, мл | Вода, мл | Малонат, мл | 2,6-дихлорфеноліндофенол |
| 0,5 | – | 2 краплі | ||
| 0,5 | – | 2 краплі | ||
| 1,5 | – | 2 краплі | ||
| – | 0,5 | 2 краплі |
Через 15 хв спостерігають зникнення синього кольору в другій пробірці.
Практичне значення. У клініко-біохімічних дослідженнях використовують методи визначення окислювально-відновних ферментіву біоптатах для оцінки енергетичного обміну при різних патологічних станах, а також для токсикології та фармакології при вивченні дії лікарських засобів та отрут, які можуть бути роз’єднувачами або інгібіторами.
ЛІТЕРАТУРА
1. Губський Ю.І. Біологічна хімія / Ю.І. Губський. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. –С. 115–121, 137–142.
2. Губський Ю.І. Біологічна хімія: підручник / Ю,І. Губський. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2007. – С. 175–181.
3. Гонський Я.І. Біохімія людини: підручник / Я.І. Гонський, Т.П. Максимчук, М.І. Калинський. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 244–255, 312–319.
4. Біологічна хімія / Л.М. Вороніна та ін. – Харків: Основа, 2000. – С. 257–265.
5. Березов Т.Т. Биологическая химия / Т.Т. Березов, Б.Ф. Коровкин. – М.: Медицина, 1998. – С. 343–349.
6. Биохимия: учебник / под ред. Е.С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 281–296.
7. Николаев А.Я. Биологическая химия / А.Я. Николаев. – М.: ООО Медицинское информационное агентство, 1998. – С. 212–222.
ЗАНЯТТЯ 9 ( 4 години)