Генно-инженерные работы в области повышения эффективности фотосинтеза
Фотосинтез, осуществляемый растениями, характеризуется в целом весьма низкой эффективностью, так как фотосиптетический аппарат использует лишь 3 — 4 % падающего света. Современный путь увеличения фотосиитетических возможностей культурных растений — селекция с целью ускорения раннего роста и формирования листьев, улучшения «архитектуры» растений, увеличения площади листовой пластинки и сроков жизнедеятельности этого органа. Но более важными являются следующие обстоятельства:
1) способность растений к переносу продуктов фотосинтеза в те его части, ради которых данное растение культивируется;
2) уменьшение потери сухого вещества при дыхании;
3) переключение С3-пути фотосинтеза (злаковые) па более эффективный С4-путь (кукуруза) с помощью трансгеноза группы генов.
Как известно, у всех без исключения растений связывание углекислоты осуществляется через цикл восстановления углерода Кальвина. Первый этап представляет собой карбоксилирование, которое у С3-растений происходит путем взаимодействия свободного углекислого газа с основным доступным акцептором — рибулозо-1,5-би-фосфатом, в результате чего образуются две молекулы 3-фосфогли-церата:
С02 Н20 С5->Сб -> С3+ С3
Реакция катализируется рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазой (РБК), которая локализована на обращенной к строме поверхности мембран тилакоидов. Это лимитирующая стадия в функционировании цикла Кальвина. У растений и фототрофов на свету идет ее ускорение.
Второй стадией цикла у С3-растепий является восстановление З'-фосфоглицерата за счет энергии фотореакции до триозофосфата.
На первой стадии у С4-растений акцептором С02 в форме бикарбоната выступает не рибулозо-1,5-бифосфат, а фосфоеиолпируват, который в результате реакции карбоксилирования превращается в ок-салоацетат, последний далее — в малат и аспартат:
со2
Оо —^ 04
Реакция осуществляется ферментом — фосфоеиолпируваткарбок-силазой (ФЕПК). Основное значение этого дополнительного этапа к циклу Кальвина у С4-растений состоит в том, что ФЕПК и субстрат расположены в мезофильных клетках, соприкасающихся с воздухом, а образовавшиеся Отсоединения транспортируются в клетки обкладки сосудистого пучка, которые служат основным местом локализации фотосиитетической системы и компонентов указанного цикла. Здесь ^-соединения подвергаются декарбоксилированию, в результате чего создается высокая концентрация С02, вступающего в цикл Кальвина. Это не что иное, как углекислая помпа, перекачивающая углекислоту и создающая высокую локальную ее концентрацию. Эффективность фотосинтеза у С4-растений повышается, однако при этом возрастают и их энергозатраты.
Основное внимание в генно-инженерных проектах уделяется механизму увеличения концентрации С02 и повышению сродства РБК с этой кислотой. Например, полиплоидизация растений ведет к росту активности РБК. Современная задача — исследовать возможности ее получения с соотношением карбоксилазной и оксигеназной активностей, измененных в пользу карбоксилазы. Так, методами сайт-направленного мутагенеза заменили в активном центре фермента Asp на Glu, но оказалось, что снизились обе активности на 30 %. Более простой задачей явился бы перенос генов ФЕПК и декарбоксилазы в С3-растения, не элиминирующий при этом собственные РБК С3-ти-па и всей сопутствующей системы карбоксилирования. Также можно путем трапсгеноза гена ангидразы либо путем его амплификации увеличить концентрацию углекислоты в органе л лах клеток листа.
Генно-инженерные работы
В области увеличения содержания
Незаменимых аминокислот
Важная потенциальная область применения генно-инженерных подходов в растениеводстве — улучшение качества зерна основных злаковых культур, прежде всего изменение аминокислотного состава запасных белков. Как известно, в запасном белке большей части злаковых имеется дефицит лизина и в меньшей степени — треонина, что заметно снижает их пищевую и кормовую ценность. Введение в эти белки дополнительного количества дефицитных аминокислот могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс.
В ряде случаев методами традиционной селекции удавалось существенно повысить содержание в запасных белках злаковых лизина, но такие культивары не получили распространения ввиду заметного ухудшения урожайности. В настоящее время преодоление дефицита незаменимых аминокислот в корме свиней и птицы обеспечивается в значительной мере добавлением продуктов микробиологического синтеза белка. Однако стоимость кормовых добавок достаточно высока.
Весьма перспективно решение этой проблемы путем устранения белкового дефицита непосредственно в растении благодаря изменению аминокислотного состава запасных белков. У злаковых, в частности у пшеницы и ячменя, основными из них являются спиртора-створимые проламины, содержащие не более 0,9 % лизина. Для получения сбалансированного по лизину белка злаковых в их проламины следует ввести 15 — 20 лизиновых остатков в полипептидную цепочку или же заменить часть проламинов на богатый лизином белок.
С помощью традиционных генетико-селекционных методов в ряде случаев удавалось получить линии и сорта злаковых с повышенным содержанием лизина за счет уменьшения доли проламина в зерне, но ни одна из этих линий не стала хозяйственно ценным сортом ввиду уменьшения размеров зерна и снижения урожайности.
Существует генно-инженерный проект, рассчитанный на создание рекомбинантных растений злаков либо с амплифицированными генами белков зерна, богатых лизином, либо с генами этих белков, подстроенных под более сильные промоторы. Второй подход предполагает, что улучшать аминокислотный состав можно за счет модификации полипептидной цепи проламинов, с тем чтобы повысить процентное содержание лизина с помощью изменения нуклеотидной последовательности кодонов при том же общем количестве белка. Третий путь увеличения свободного лизина в зерне состоит в химическом синтезе генов, которые программируют неприродные полипептиды, построенные в основном из незаменимых аминокислот. Был получен ген НБНА, кодирующий белок с высоким содержанием лизина, который легко деградировался в организме животных. Он был встроен в плазмидную конструкцию, созданную на основе плазмид A. rhisogenes и A. tumefaciens. В качестве селективного гена был использован ген антибиотико-резистентности. Удалось трансформировать клетки растений табака этими рекомбинантными плазмидами и регенерировать химерные растения, в которых ген НБНА экспрес-сировался, программируя синтез искусственного белка.
Оценивая в целом итоги и перспективы работ по улучшению аминокислотного состава запасных белков различных растений методами генной инженерии, можно отметить, что устранение дефицита незаменимых аминокислот окажется возможным лишь при успешной реализации нескольких из обсуждавшихся выше подходов.
Генно-инженерные работы