Пропионово-кислое брожение

Общая характеристика пропионово-кислого брожения.Пропио-иово-кислые, или пропионовые, бактерии были впервые выделены из сыров в 1878 г. Фитцем, и сыроделие — самая древняя биотехнология, их использующая. Свое название они получили в связи с образовани­ем при брожений больших количеств пропионовой кислоты. Характе­ризуются выделением в значительном количестве корриноидов (вита­мин В12) и каталазы, даже при росте в анаэробных условиях. Пред­ставлены бесспоровыми, неподвижными грамположительными палоч­ками (0,5 х 0,7 + 2,0 мкм) и объединены в семейство Propioni-bacteriaceae. Пропионово-кислые бактерии по современной класси­фикации подразделены на четыре вида, вместо одиннадцати ранее опи­санных.

В последние годы в род Propionibacterium предложено включить кокки, участвующие в брожении. Пропионовые бактерии содержат все ферменты цикла трикарбоновых кислот и имеют с палочковидными бактериями много общих фенотипических свойств и высокую степень гомологии ДНК. Кокки выделяют из молока и сыров на ранних ста­диях созревания. В отличие от типичных пропионовых бактерий они растут на поверхности плотных сред.

В целом пропионово-кислые бактерии обладают хорошими синте-тическими способностями и могут расти на простой синтетической среде следующего состава: соединение углерода, сульфат аммония, К2НР04, С12 хбН20, биотин, тиамин, пантотеновая кислота.

Из 1,5 моль глюкозы в результате брожения образуются до 2,0 моль пропионовой кислоты, 1,0 моль уксусной кислоты, 1,6 моль С02, синтезируется до б моль АТФ.

В брожении участвует 19 ферментов. В качестве их кофакторов выступает тиаминдифосфат — в составе пируватдегидрогеназы, био­тин — в составе метилмалонил-КоА-транскарбоксилазы, пантотено­вая кислота — как составная часть Ко А, витамин В12 — в своей ко-ферментной форме как компонент метилмалонил-КоА-изомеразы. Три первых витамина бактерии самостоятельно не синтезируют, витамин В12 образуется в больших количествах, намного превышающих нор­му для изомеразной реакции.


Наиболее активными кислотообразователями являются штаммы P. freudenreichii и пропионово-кислые кокки, чаше всего встречающиеся в сырах сортов «Советский» и «Швейцарский». Наиболее активны­ми продуцентами витамина Bt2 являются P. shermanii, P. freuden­reichii и P. acnes. Эти же штаммы накапливают наибольшую био­массу. Первые два вида находят широкое применение в промыш­ленности. Содержат бактерии также активные флавооксидазы.

Кроме субстратного фосфорилирования бактерии способны к окис­лительному фосфорилированию, сопряженному с переносом электро­нов с цитохрома на фумарат и образованием из пего сукципата.

Несмотря на наличие и функционирование аппарата, обеспечива­ющего аэробный образ жизни, а также супероксиддисмутазы и катала-зы, бактерии проявляют явную тенденцию к анаэробиозу. Причина этого явления до конца не выяснена. Предполагают, что анаэробиоз пропионовых бактерий вызывается высокой чувствительностью SH-содержащих ферментов к молекулярному кислороду, с одной сторо­ны, и низкой эффективностью окислительного фосфорилирования — с другой. Однако в присутствии кислорода эти бактерии не погибают.

Использование пропионово-кислых бактерий.Пропионово-кис­лые бактерии давно уже используются при изготовлении твердых сы­чужных сыров с высокой температурой (55 — 58 °С) второго нагре­вания. К таким относятся сыры сортов «Советский», «Швейцарский», «Бийский», «Алтайский». В их созревании кроме P. shermanii уча­ствуют также Streptococcus thermophilus, Lactobacterium helveticum, L. lactis. Молочно-кислые бактерии превращают лактозу в лактат, осу­ществляют протеолиз казеина, образуют ароматические вещества. Про-пионовые бактерии из лактозы и лактата синтезируют пропиоиовую, уксусную кислоты и выделяют углекислоту, которая в значительной степени обусловливает рисунок сыра.

Пропионовым бактериям присуща высокая липолитическая ак­тивность, способствующая образованию жирных кислот: пропионовой, уксусной, миристиновой, пальмитиновой, стеариновой и олеиновой. Все они способствуют созданию аромата сыра. Функцию ароматизатора в швейцарском сыре выполняют также пролин, в большом количестве выделяемый P. shermanii, и летучие карбонильные соединения.

Значительная термо- и солеустойчивость (до 2,5 % NaCl), а также способность пропионово-кислых бактерий расти при 10 — 14 °С соот­ветствуют особенностям технологии выработки твердых сычужных сыров.

Пропионовые бактерии вносят в закваску определенных сортов кефира, обогащая последний витамином В12. Для его получения необ­ходимы молочно-кислые, уксусно-кислые и пропионово-кислые бак­терии.

Пропионово-кислые бактерии используются как продуценты вита­мина В12. Пропионовая кислота представляет большой практический интерес как консервант (фунгицид). Зерно и комбикорма, обработанные


ею, долго сохраняются даже при влажной погоде и не плесневеют. Эту кислоту можно использовать при хранении сливочного масла (его заворачивают в бумагу, пропитанную пропионовой кислотой), черного хлеба, консервов. Она хорошо усваивается и в небольших количест­вах безвредна для человека. Уксусная кислота, как известно, также обладает консервирующими свойствами. Поэтому для целей консер­вирования эти кислоты можно не разделять.

На основе бактерий рубца, в состав которых входит P. acnes, соз-дан препарат «Пропиовит». В последние годы в связи с применением антибиотиков, сульфамидных средств и различных подкормок у сель­скохозяйственных животных часто возникает дисбактериоз, что ведет к массовым заболеваниям и гибели молодняка.

Применение бактериальных препаратов способствует восстанов­лению нормальной микрофлоры. Использование «Пропиовита» при выращивании сельскохозяйственных животных и птиц повышает их сопротивляемость неблагоприятным воздействиям, увеличивает при­росты, сокращает потери от заболеваемости и гибели, стимулирует развитие полезной микрофлоры кишечника.

При контакте с кислородом в клетках пропиопово-кислых бак­терий образуются супероксидные радикалы, которые, однако, не на­капливаются благодаря наличию у них супероксиддисмутазы (СОД), осуществляющей следующую реакцию:

202 + 2Н+->Н202 + 02

Образуемые в реакции пероксиды разлагаются при участии ката-лазы и пероксидазы, синтезируемых этими бактериями. СОД пропи-оновых бактерий — термостабильиый железосодержащий белок. В форме, очищенной до гомогенного состояния, он рекомендован как лекарственный препарат при лечении воспалительных процессов и лучевой болезни. До настоящего времени СОД получали из эритро­цитов крови. Комплекс антиокислительных ферментов — СОД, ката-лаза и пероксидаза — применяется в ряде стран в пищевой промыш­ленности в целях предотвращения окисления липидов и других цен­ных компонентов пищевых продуктов. Поэтому бесклеточный экст­ракт безвредных пропионовых бактерий рекомендован как антиокис­лительный и витаминный препарат для пищевой промышленности.

Ацетонобутиловое брожение

Общая характеристика брожения, микроорганизмы.Бутиловый спирт — продукт брожения некоторых разновидностей масляно-кис-лых бактерий - обнаружен Л. Пастером в 1862 г. Несколько позднее Бейеринк выделил палочковидную бактерию, сбраживающую глице­рин с образованием в числе продуктов брожения бутилового спирта. Более подробно вопросом получения в результате брожения бутанола занимались Фитц и Бухнер, а Шардингер (1905) установил, что неко-


торые бактерии при росте на средах с углеводами накапливают аце­тон. Но все эти исследования сначала представляли чисто теоретиче­ский интерес. Положение, однако, изменилось в 1909 г., когда бутило­вым спиртом заинтересовались как возможным исходным продуктом для синтеза каучука (через бутадиен). Первый ацетонобутиловый за­вод был построен в Англии в 1914 г.

В период Первой мировой войны еще большее значение приобрел ацетон, необходимый для приготовления взрывчатых веществ. Про­дукты брожения применяются для нужд нитроцеллюлозной и лако­красочной промышленности, производства фотопленок, ацетилцеллю-лозы, органического стекла и других отраслей химической и фарма­цевтической промышленности.

Несколько позже заводы по производству растворителей были построены в Канаде, США, Индии.

Промышленное получение в СССР бутилового спирта и ацетона путем брожения явилось результатом работ коллектива ученых, руко­водимого Шапошниковым. Проведенные ими исследования позволи­ли в 1935 г. наладить производство этих продуктов микробиологиче­ским способом.

Бактерии, образующие в процессе своей жизнедеятельности в зна­чительном количестве ацетон и бутиловый спирт, широко распростра­нены в природе. Они находятся в основном в почве, откуда могут быть довольно легко выделены в виде чистых культур. Относятся к роду Clostridium, который включает большое число видов. Из различных клостридиев, способных к образованию в процессе брожения бутано-ла и ацетона, наиболее активным их продуцентом признан Clostridium acetobutylicum, применяемый для производства этих растворителей.

Рост культур происходит только в анаэробных условиях на до­вольно простых средах, содержащих различные углеводы. Кроме них С. acetobutylicum может сбраживать глицерин, маннит, глюкоиат, пи-руват и некоторые другие вещества. Нуждается в таких витаминах, как биотин и парааминобензойная кислота. Бактерия способна к фик­сации молекулярного азота. Наиболее подходящая температура для роста — 37 — 38 °С, оптимальное значение рН среды — 5,1 — 6,9.

Благодаря наличию амилолитических ферментов бактерия исполь­зует крахмал. Выделяет в среду протеиназы, в результате чего спо­собна разлагать белки. Поэтому С, acetobutylicum относят к группе протеолитических клостридиев.

Сбраживание этой бактерией углеводов, как и другими клостриди-ями, происходит по фруктозобисфосфатному пути, т. е. по пути Эмб-дена —Мейергофа—Парнаса. Продуктами брожения являются уксус­ная и масляная кислоты, ацетон, бутанол, этанол, а также С02 и Н2. Но состав продуктов и их количества в процессе брожения зависят от условий, в которых оно происходит.

В течение первой фазы наблюдаются активный рост культур и накопление в среде преимущественно органических кислот. Во вто­рой фазе рН среды снижается, рост культур замедляется, преобладает


образование нейтральных продуктов, а именно ацетона, бутанола и этанола. В то же время количество органических кислот в среде мо­жет даже уменьшаться.

Аналогичная двухфазность, как было установлено в дальнейшем, характерна для большинства процессов брожений, а также некоторых других микробиологических процессов, что важно знать для их прак­тического применения.

Для ацетонобутилового брожения четко показано, что его двух­фазность связана с рН среды. Если это значение в результате накоп­ления органических кислот падает до 4,5 и ниже, начинается интен­сивное образование нейтральных продуктов. В результате этого пре­дупреждается дальнейшее подкислепие среды, неблагоприятное для бактерий. Если значение рН среды путем добавления в нее мела или другими способами поддерживать на уровне 5,0 и выше, то образова­ния в большом количестве ацетона, бутанола и этанола не происхо­дит.

Установлено, что при низких значениях рН у С. acetobutylicum увеличивается активность ферментов, катализирующих превращение ацетоацетил-КоА в ацетон, и НАДН используется на восстановление 6утирил-КоА до бутанола. Кроме того, последний может частично синтезироваться из ранее образованной масляной кислоты, вновь по­ступающей в клетки из среды и превращающейся в бутирил-КоА. Поэтому для получения в большом количестве нейтральных продук­тов важно соблюдать определенные условия процесса брожения.

Среды и культуры, используемые в производстве.Ацетоиобу-тиловое брожение в производственных условиях может вестись на разных углеводсодержащих средах. Вначале обычно использовали среды, включающие кукурузную, пшеничную или ржаную муку. В на­стоящее время в качестве основного сбраживаемого субстрата неред­ко применяют мелассу и некоторые другие дешевые вещества. Сбражи­ваемые углеводы не подвергают предварительному осахариванию. Поэтому содержащие их среды именуются заторами (в Отличие от сусла — осахарегшой среды спиртового брожения).

Обычно применяют заторы, содержащие около б % углеводов. Использовать среды с большим количеством сбраживаемых субстра­тов нецелесообразно, так как образуемый при брожении бутаиол уже в концентрации 1,5 % подавляет жизнедеятельность бактерий и бро­жение прекращается. Поэтому часть углеводов, если их много, остает­ся неиспользованной.

В случае когда в качестве субстрата для брожения применяют муку, ее предварительно взвешивают на автоматических весах, а затем через дозатор направляют на смешение с водой при 50 — 60 °С. Замес проходит ловушки для улавливания комков, а также случай­ных примесей и поступает на разваривание в варочно-стерилизацион-ные колонки, где нагревается паром до 145 — 160 °С и выдерживает­ся при такой же температуре в трубчатых вертикальных сосудах от


20 до 40 мин, постепенно продвигаясь по ним. Проходя через сепара­тор пара, затор подается центробежным насосом в холодильник типа «труба в трубе», охлаждается до температуры брожения (35 - 36 'С) и поступает в бродильное отделение.

Среды, содержащие мелассу или гидролизаты растительных отхо­дов, стерилизуют в более мягких условиях (115 — 120 °С, 18 — 20 мин), после чего их смешивают с мучным затором.

Для нормального проведения процесса ацетоиобутилового бро­жения важно, чтобы в среде имелись в достаточном количестве белки, как в мучных заторах.

Для выращивания чистой культуры С. acetobutylicum пользуют­ся запасом спор бактерии, который заготавливают обычно на шести­месячный (и более) период работы завода.

Уже в первые часы после ииокулировапия затора активной куль­турой бактерий наблюдается брожение, заметное по пузырькам газа, поднимающимся к поверхности среды. Газовыделение достигает мак­симума обычно через 24 — 26 ч. В этот период происходит характер­ное расслоение субстрата — на поверхность поднимается рыхлый слизистый слой, внизу остается мутноватая опалесцирующая жидкость. Вся среда приобретает желтоватую окраску. Это явление в произвол-стве именуется подъемом бражки и считается одним из признаков нормального брожения, к концу которого поднявшаяся твердая часть субстрата оседает на дно и газовыделение прекращается. Для ацето­иобутилового брожения характерной является также форма кривой титруемой кислотности. Развитие бактерий характеризуется быстрым нарастанием последней, которая достигает максимума к 12 — 16 ч брожения, и затем резко снижается к 24 — 25-му часу, после чего снова происходит небольшой ее подъем. Во время повышения кис­лотности рН среды снижается с 6,0 до 4,2 — 4,1 и остается на этом уровне с небольшими колебаниями.

Образование ацетона и спиртов начинается примерно с 6-го часа брожения, но наиболее интенсивно происходит после перелома кри­вой кислотности. В них превращается 33 — 35 % углеводов, и в конеч­ной бражке содержится около 2 % растворителей.

Полунепрерывный метод брожения в ацетонобутиловом про­изводстве, известный под названием батарейного, имеет ряд преиму­ществ по сравнению с периодическим и прочно укоренился в пашей промышленности. Батарея состоит из 6 — 8 ферментеров, последова­тельно соединенных трубами. Головной из них — активатор — засе­вают культурой из инокулятора и после перелома кривой кислотно­сти (примерно через 12 ч) начинают загружать мучным затором. Че­рез активатор заполняется вся батарея. Ее разгрузка (передача бражки на ректификацию) производится с последнего — хвостового — фер­ментатора; после стерилизации он становится активатором следую­щей батареи, состоящей из тех же ферментаторов, но загружаемых в обратном направлении.


Непрерывное брожение облегчило замену большого количества муки (до 70 %) более дешевым сырьем: свеклосахарной патокой (ме­лассой) и гидролизатами отходов растительного сырья.

Для первой фазы брожения целесообразнее применять мучной за­тор, что обеспечивает быстрый рост бактерий и образование фермен­тов для синтеза растворителей.

Мелассу и гидролизаты вводят при переходе брожения во вторую фазу.

Разработана двухпоточная схема непрерывного брожения, пред­полагающая, что мучной или паточио-гидролизатиый мучной затор направляется в первый (головной) ферментатор батареи, а также на разведение чистой культуры в инокулятор, мелассный затор — во вто­рой ферментатор, где происходит переход во вторую фазу брожения.

В результате внедрения способа непрерывного брожения на нарт-калинском ацетоновом заводе при переработке смешанных заторов (с заменой 70 % муки) по сравнению с прежней полунепрерывной схемой производительность заметно возрастала. Весь процесс ацето-нобутилового брожения, будь то периодический, полунепрерывный или непрерывный, ведется в строго стерильных условиях: в герметически закрытых ферментаторах под небольшим избыточным давлением (0,4 • 105 — 0,8 105 Па), создаваемым газами брожения. При выде­лении они удаляются через специальные коммуникации — выбрасы­ваются в атмосферу или направляются на переработку (например, в жидкую углекислоту или сухой лед).

Наибольшую опасность для производства представляют молоч-по-кислые бактерии и бактериофаги, быстро и полностью подавляю­щие рост ацетонобутиловых бактерий. Главная причина попадания бактериофага в производство объясняется тем, что он легко задержи­вается в трещинах сварных швов ферментаторов, в трубопроводах и других плохо прогреваемых и порой незаметных участках оборудова­ния. Кроме возможного устранения таких участков наиболее эффектив­ной мерой борьбы с этим вирусом является стерилизация при 120 °С не менее 20 мин. В результате внедрения непрерывной схемы в ацетоно-бутиловом производстве значительно улучшаются условия стериль­ности и сокращаются случаи инфицирования в процессе брожения.

Ацетонобутиловая бражка кроме ацетона, бутилового и этилового спиртов содержит ряд побочных продуктов, для разделения которых применяют довольно сложную перегонку и ректификацию. Изложим только принципиальные особенности этих операций.

Вначале на ацетоновой колонне отделяется ацетон — продукт с наиболее низкой температурой кипения (56,2 °С). Затем на другой колонне ограничивают этанол (температура кипения — 78,4 °С). Не­сколько сложнее обстоит дело с выделением и обезвоживанием бута-иола. Его смесь с водой образует два слоя: верхний — раствор воды в бутаноле (80 % бутаиола и 20 % воды), его называют «богатой сме­сью», и нижний — раствор бутанола в воде (8 % бутаиола и 92 %


воды), его называют «бедной смесью». Их разделение производится в сосуде-разделителе. Перегонка и обезвоживание бутаиола основаны на его свойстве перегоняться вместе с водой (водяным паром) в виде азеотропной смеси, кипящей при 93,4 °С и содержащей 59 % спирта и 41 % воды. Таким образом, при перегонке «богатой смеси» с верхней части колонны вся вода удаляется, а с нижней части отходит безвод­ный бутанол, который затем окончательно очищается на бутаноловой колонне (температура кипения бутаиола — 117,7 °С). При перегонке «бедной смеси» из нижней части лютерной колонны отходит лютер-ная вода, а с верхней части — азеотропная смесь, направляемая потом в соответствующий сосуд-разделитель. Основной отход ректифика­ции и всего производства — барда — содержит около 3 % сухих веществ, состоящих главным образом их азотистых соединений сы­рья. Ранее она использовалась обычно для откорма скота, но затем на ряде заводов были построены дрожжевые цехи для выращивания на барде кормовых дрожжей.


Глава 6