Приготовление гистологических препаратов

Гистологический препарат любой формы должен отвечать следующим требованиям:

· сохранять прижизненное состояние структур;

· быть достаточно тонким и прозрачным для изучения его под микроскопом в проходящем свете;

· быть контрастным, то есть изучаемые структуры должны под микроскопом четко определяться;

· препараты для световой микроскопии должны долго сохраняться и использоваться для повторного изучения.

Эти требования достигаются при приготовлении препарата.

Выделяют следующие этапы приготовления гистологического препарата.

· Взятие материала (кусочка ткани или органа) для приготовления препарата. При этом учитываются следующие моменты:

· забор материала должен проводиться как можно раньше после смерти или забоя животного, а при возможности от живого объекта (биопсия), чтобы лучше сохранились структуры клетки, ткани или органа;

· забор кусочков должен производиться острым инструментом, чтобы не травмировать ткани;

· толщина кусочка не должна превышать 5 мм, чтобы фиксирующий раствор мог проникнуть в толщу кусочка;

· обязательно производится маркировка кусочка (указывается наименование органа, номер животного или фамилия человека, дата забора и так далее).

· Фиксация материала необходима для остановки обменных процессов и сохранения структур от распада. Фиксация достигается чаще всего погружением кусочка в фиксирующие жидкости, которые могут быть простыми спирты и формалин и сложными раствор Карнуа, фиксатор Цинкера и другие. Фиксатор вызывает денатурацию белка и тем самым приостанавливает обменные процессы и сохраняет структуры в их прижизненном состоянии. Фиксация может достигаться также замораживанием (охлаждением в струе СО₂, жидким азотом и другие). Продолжительность фиксации подбирается опытным путем для каждой ткани или органа.

· Заливка кусочков в уплотняющие среды (парафин, целлоидин, смолы) или замораживание для последующего изготовления тонких срезов.

· Приготовление срезов на специальных приборах (микротоме или ультрамикротоме) с помощью специальных ножей. Срезы для световой микроскопии приклеиваются на предметные стекла, а для электронной микроскопии - монтируются на специальные сеточки.

· Окраска срезов или их контрастирование(для электронной микроскопии). Перед окраской срезов удаляется уплотняющая среда (депарафинизация). Окраской достигается контрастность изучаемых структур. Красители подразделяются на основные, кислые и нейтральные. Наиболее широко используются основные красители (обычно гематоксилин) и кислые (эозин). Нередко используют сложные красители.

· Просветление срезов (в ксилоле, толуоле), заключение в смолы (бальзам, полистерол), закрытие покровным стеклом.

После этих последовательно проведенных процедур препарат может изучаться под световым микроскопом.

Для целей электронной микроскопии в этапах приготовления препаратов имеются некоторые особенности, но общие принципы те же. Главное отличие заключается в том, что гистологический препарат для световой микроскопии может длительно храниться и многократно использоваться. Срезы для электронной микроскопии используются однократно. При этом вначале интересующие объекты препарата фотографируются, а изучение структур производится уже на электронограммах.

Из тканей жидкой консистенции (кровь, костный мозг и другие) изготавливаются препараты в виде мазка на предметном стекле, которые также фиксируются, окрашиваются, а затем изучаются.

Из ломких паренхиматозных органов (печень, почка и другие) изготавливаются препараты в виде отпечатка органа: после разлома или разрыва органа, к месту разлома органа прикладывается предметное стекло, на которое приклеиваются некоторые свободные клетки. Затем препарат фиксируется, окрашивается и изучается.

Наконец, из некоторых органов (брыжейка, мягкая мозговая оболочка) или из рыхлой волокнистой соединительной ткани изготавливаются пленочные препараты путем растягивания или раздавливания между двумя стеклами, также с последующей фиксацией, окраской и заливкой в смолы.

Методы исследования

Основным методом исследования биологических объектов, используемым в гистологии является микроскопирование, т. е. изучение гистологических препаратов под микроскопом. Микроскопия может быть самостоятельным методом изучения, но в последнее время она обычно сочетается с другими методами (гистохимии, гисторадиографии и другие). Следует помнить, что для микроскопии используются разные конструкции микроскопов, позволяющие изучить разные параметры изучаемых объектов. Различают следующие виды микроскопии:

· световая микроскопия (разрешающая способность 0,2 мкм) наиболее распространенный вид микроскопии;

· ультрафиолетовая микроскопия (разрешающая способность 0,1 мкм);

· люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия для определения химических веществ в рассматриваемых структурах;

· фазово-контрастная микроскопия для изучения структур в неокрашенных гистологических препаратах;

· поляризационная микроскопия для изучения, главным образом, волокнистых структур;

· микроскопия в темном поле для изучения живых объектов;

· микроскопия в падающем свете для изучения толстых объектов;

· электронная микроскопия (разрешающая способность до 0,1-0,7 нм), две ее разновидности просвечивающая (трансмиссионная) электронная микроскопия и сканирующая или растровая микроскопии дает отображение поверхности ультраструктур.

Гистохимические и цитохимические методы позволяет определять состав химических веществ и даже их количество в изучаемых структурах. Метод основан на проведении химических реакций с используемым реактивом и химическими веществами, находящимися в субстрате, с образованием продукта реакции (контрастного или флюоресцентного), который затем определяется при световой или люминесцентной микроскопии.

Метод гистоавторадиографии позволяет выявить состав химических веществ в структурах и интенсивность обмена по включению радиоактивных изотопов в изучаемые структуры. Метод используется чаще всего в экспериментах на животных.

Метод дифференциального центрифугирования позволяет изучать отдельные органеллы или даже фрагменты, выделенные из клетки. Для этого кусочек исследуемого органа растирают, заливают физиологическим раствором, а затем разгоняют в центрифуге при различных оборотах (от 2-х до 150 тыс.) и получают интересующие фракции, которые затем изучают различными методами.

Метод интерферометрии позволяет определить сухую массу веществ в живых или фиксированных объектах.

Иммуноморфологические методы позволяет с помощью предварительно проведенных иммунных реакций, на основании взаимодействия антиген-антитело, определять субпопуляции лимфоцитов, определять степень чужеродности клеток, проводить гистологическое типирование тканей и органов (определять гистосовместимость) для трансплантации органов.

Метод культуры клеток (in vitro, in vivo) - выращивание клеток в пробирке или в особых капсулах в организме и последующее изучение живых клеток под микроскопом.

Единицы измерения, используемые в гистологии

Для измерения структур в световой микроскопии используются в основном микрометры: 1 мкм составляет 0,001 мм; в электронной микроскопии используются нанометры: 1 нм составляет 0,001 мкм.