Тема: Микробиологическая диагностика бактериальных кишечных инфекций
ЗАНЯТИЕ
Цель: На основе знаний свойств возбудителей бактериальных кишечных инфекций, их морфофизиологических, биохимических и серологических свойств, эпидемиологии и особенностей патогенеза вызываемых ими заболеваний уметь обосновать тактику микробиологической диагностики и профилактику вызываемых ими заболеваний.
Знать:
1. Особенности возбудителей бактериальных кишечных инфекций, определяющие их роль в инфекционной патологии человека.
2. Морфофизиологические и биохимические свойства, особенности эпидемиологии, патогенеза и иммунитета, вызываемых ими заболеваний.
3. Материал и методы микробиологической диагностики бактериальных кишечных инфекций.
4. Неспецифическую профилактику бактериальных кишечных инфекций.
Уметь:
1. Отобрать на средах первичного посева характерные для бактериальных кишечных инфекций колонии.
2. Изучить морфо-тинкториальные свойства и проверить чистоту выделенных культур.
3. Учесть и оценить результаты изучения биохимических (среда Ресселя, «пестрый ряд») и антигенных свойств культур с целью их идентификации.
4. Учесть и оценить результаты РА с целью серологической идентификации культуры.
5. Заполнить бланки-направления и бланки-ответы из бак. лаборатории.
Контрольные вопросы:
1. Классификация и морфофизиологические свойства возбудителей бактериальных кишечных инфекций.
2. Факторы вирулентности возбудителей бактериальных кишечных инфекций.
3. Особенности эпидемиологии и патогенеза заболеваний, вызываемых возбудителями бактериальных кишечных инфекций.
4. Материалы и методы микробиологической диагностики.
5. Оценка чувствительности выделенных штаммов к антибиотикам.
Задания, выполняемые в ходе занятия:
Задание 1. Провести микроскопию Грам отрицательных бактериальных культур. Окраска по методу Грама.
Escherichia coli Shigella sonnei Salmonella enterica
subsp. Enteritidis
 |  | | |||
Salmonella enterica
subsp.Typhimurium Proteus vulgaris Klebsiella pneumoniae
 | | |
Задание 2. Задача. Бактериологическая диагностика колиэнтеритов.
В бактериологическую лабораторию поступил материал (испражнения) от больного с подозрением на острый колит. В анамнезе: учащенный стул с примесью слизи и, часто, тенезмами, схваткообразными болями в животе. Были проведены следующие лабораторные тесты:
1). Посев исследуемого материала на среду Эндо (питательная основа, сульфит натрия и фуксин основной - подавляют рост грамположительных микроорганизмов, a-D-лактоза):
Оцените результат. Опишите, выявленные колонии:
Объясните причину окраски колоний на среде Эндо:
2). Провели тест на каталазу
Контроль Опыт
Вывод:
3). Определяли биохимические свойства выделенной культуры:
| Подвиж- ность (0,3% агара) | Среда Олькеницкого | Ман- нит | Цитрат Сим- монса | Мало- нат | Фенил-аланин | Жела-тина | Лизин | |||
| Глю- коза | лак- тоза | моче- вина | H2S | |||||||
| + | кг | кг | - | - | к | - | - | - | - | +/х |
Сравните полученные данные с таблицей и определите род микроорганизма-возбудителя заболевания.
Биохимические свойства грамотрицательных бактерий
| Семей- ство | Род микроба | Подвиж- ность (0,3% агара) | Среда Олькеницкого | Ман- нит | Цитрат Симмонса | Малонат | Фенилаланин | Желатина | Лизин | |||
| Глю- коза | лак- тоза | моче- вина | H2S | |||||||||
| Ente- robac- teria- ceae | Escherichia | + | кг | кг | - | - | к | - | - | - | - | +/х |
| Citrobacter | + | кг | кг | - | +/- | к | + | - | - | - | - | |
| Klebsiella | - | кг | к+/- | (+) | - | к | + | + | - | - | + | |
| Enterobacter | +/- | кг | кг+/- | +/- | - | к | + | + | - | + | +/- | |
| Hafnia | +/- | +/- | +/- | - | - | к | х | х | - | - | + | |
| Serratia | + | к | к+/- | +/- | - | к | + | - | - | + | + | |
| Arisona | + | кг | х | - | + | к | + | + | - | (+) | + | |
| Shigella | - | к | - | - | - | к | - | - | - | - | + | |
| Salmonellа | +/- | кг | - | - | + | кг | + | - | - | - | + | |
| Pro- teus | Proteus | + | кг | - | + | +/- | к | +/- | - | + | + | - |
| Providencia | +/- | к+/- | - | - | - | - | + | - | + | - | - | |
| Pseu- domo- daceae | Ps. aeruginosa | + | к | - | + | - | - | + | + | + | - | + |
Среда Олькеницкого
(ТУ 9229-072-00419785-97)
Среда предназначена для дифференциации энтеробактерий по способности сбраживать углеводы в присутствии индикатора и железосульфатного комплекса
При ферментации глюкозы и лактозы среда краснеет, при разложении мочевины -приобретает желтое окрашивание, при образовании сероводорода появляется почернение на дне пробирки.
4). Провели серологическую идентификацию чистой культуры. Оцените результат РА на стекле с агглютинирующими сыворотками:
| Агглютинация | |
| Колисыворотка 0111:В4 | 
|
| Колисыворотка 015 | 
|
| Колисыворотка 0112 | 
|
| Колисыворотка 0155 Н7 | 
|
Вывод:
Возбудители Esherichia coli четырех подгрупп:
- энтеропатогенные (ЭПЭ), серотипы 026:В6, 055:В5, 086:В7, 0111:В4, 0124—0128;
- энтеротоксигенные (ЭТЭ), серотипы 06-09, 015, 020;
- энтероинвазивные (ЭИЭ), серотипы 028, 032, 0112, 0115, 0124
- энтерогеморрагические (ЭГЭ), серотипы 0155 Н7 и др., выделяющие цитотоксины.
5). Определили чувствительность к антибиотикам:
ампициллин гентамицин
имипенем ципрофлоксацин цефотенам
Вывод:
Задание 3. Задача. Бактериологическая диагностика дизентерии.
В бактериологическую лабораторию поступил материал от больного с подозрением на дизентерию. В анамнезе: повышение температуры тела до 38-39°С, озноб, головная боль, тошнота, рвота. Больного беспокоят режущие схваткообразные боли в левой подвздошной области. Частый жидкий стул, без патологических примесей, с течением заболевания с большим количеством слизи с прожилками крови, а иногда и примеси гноя.
1). Какой материал можно взять для исследования:
Были проведены следующие лабораторные тесты:
2). Посев на среду Плоскирева (предназначена для выделения бактерий родов Shigella и Salmonella в состав среды входит лактоза).
Определите какие колонии являются подозрительными.
2). Посев на среду Эндо и среду с глюкозой:
|
|
Вывод:
3). Определяли биохимические свойства выделенной культуры:
| Подвиж- ность (0,3% агара) | Среда Олькеницкого | Ман- нит | Цитрат Сим- монса | Мало- нат | Фенил-аланин | Жела-тина | Лизин | |||
| Глю- коза | лак- тоза | моче- вина | H2S | |||||||
| - | к | - | - | - | к | - | - | - | - | + |
Сравните полученные данные с таблицей (см. задача 1) и определите род микроорганизма-возбудителя заболевания.
4). Провели серию серологических реакций для идентификацию чистой культуры. Оцените результат РА на стекле с агглютинирующими сыворотками:
Этап №1
| Агглютинация | |
| Смесь агглютинирующих сывороток к Shigella sonnei и Shigella flexneri | 
|
| Смесь агглютинирующих сывороток к другим видам шигелл | 
|
| Контроль физ.р-р | 
|
Этап №2
| Агглютинация | |
| Агглютинирующая сыворотка к Shigella sonnei | 
|
| Агглютинирующая сыворотка к Shigella flexneri |
|
| Контроль физ.р-р |
|
Вывод:
Задание 4. Задача. Бактериологическая диагностика брюшного тифа и паратифов.
В бактериологическую лабораторию поступил материал от больного с подозрением на дизентерию. В анамнезе: повышение температуры до 38-39°С, выраженная слабость, анорексия, головная боль, диарея. Язык утолщен, обложен серо-коричневатым налетом, с отпечатками зубов по краям. Увеличены печень и селезенка. На коже верхних отделов живота и нижних отделов грудной клетки обнаружена сыпь, число ее элементов 5-6, по характеру розеолезная.
1). Укажите какой материал можно взять на исследование:
2). Оцените результат посева на Среду Эндо, среду с глюкозой и среду Вильсона-Блера:
|
|
| ||||
Вывод:
3). Определяли биохимические свойства выделенной культуры:
| Подвиж- ность (0,3% агара) | Среда Олькеницкого | Ман- нит | Цитрат Сим- монса | Мало- нат | Фенил-аланин | Жела-тина | Лизин | |||
| Глю- коза | лак- тоза | моче- вина | H2S | |||||||
| +/- | кг | - | - | + | кг | + | - | - | - | + |
Сравните полученные данные с таблицей (см. задача 1) и определите род микроорганизма-возбудителя заболевания.
4).С целью серодиагностики поставлена реакция Видаля. Реакция Видаля — реакция агглютинации, применяемая для диагностики брюшного тифа и некоторых тифо-паратифозных заболеваний. К различным разведениям сыворотки крови больного добавляют смыв культур возбудителя (брюшного тифа, паратифов) или диагностикумы — стандартные растворы антигенов. После выдерживания в термостате наступает агглютинация в виде зерен, хлопьев, выпадающих в осадок.
| Диагностикум | Разведения сыворотки | Контроль | ||||
| 1:100 | 1:200 | 1:400 | 1:800 | Диаг. | Сыв. | |
| Брюшнотифозный О-монодиагностикум | 
+++
|
+++
| 
++
| 
-
|
-
|
-
|
| Брюшнотифозный Н-монодиагностикум |
++
|
|
|
|
|
|
| Паратифозный А ОН-диагностикум |
+
|
|
|
|
|
|
| Паратифозный В ОН-диагностикум |
+
|
|
|
|
|
|
Вывод:
Агглютинины к возбудителям брюшного тифа и паратифов обнаруживают в сыворотке крови, начиная с 8-10 дня заболевания и позднее. Динамика их накопления весьма своеобразна: сначала появляются антитела к О-антигену, но их титр быстро уменьшается после выздоровления. Н-и Vi-антитела появляются позже, но с годами сохраняются в высоких титрах после болезни, прививок и у бактерионосителей. В этой связи для правильной оценки серологической реакции важно одновременно обнаруживать все типы агглютининов. Для постановки реакции агглютинации Видаля необходимо три компонента: 1) антитела (сыворотка больного), 2) антиген (бактериальный или эритроцитарный диагностикум), 3) 0,85% раствор хлорида натрия (электролит). Для получения сыворотки у больного из вены, пальца или мочки уха в стерильную пробирку берут 2-3 мл крови, ставят ее в термостат на 30 мин для свертывания. Образовавшийся сгусток обводят пастеровской пипеткой, отделяя его от стенок пробирки, помещают на 30-40 мин в холодильник, отсасывают сыворотку и делают ее рабочее разведение 1:50. Затем в шести параллельных рядах пробирок делают следующие разведения сыворотки от 1:100 до 1:1600 по стандартной схеме. В качестве антигенов для реакции агглютинации используют брюшнотифозные монодиагностикумы О9 и Hd, а также паратифозные О-и Н-диагностикумы. Они являются 3-х млрд взвеси указанных бактерий, убитых нагреванием или формалином. О-диагностикумы готовят кипячением культур или обрабатывают их спиртом, Н-диагностикумы - обработкой культур формалином. Окончательный учет проводят через 18-20 ч нахождения пробирок при комнатной температуре. При положительной реакции агглютинации образуется белесый осадок на дне пробирки с более-менее прозрачной жидкостью над ним. При отрицательной реакции жидкость остается мутной, осадок на дне пробирки отсутствует. Агглютинацию считают специфической, когда в контрольных пробирках (КС и КД) аглютинат не образуется. При типичной клинической картине брюшного тифа диагностическим титром реакции Видаля у больных, не прививались, считают разведение 1:100 и выше, при атипичных или стертых формах заболевания - не ниже 1:200. В последнее время реакции Видаля не считают очень специфической. Она может быть положительной и при других заболеваниях, сопровождающихся лихорадкой, после прививки или ранее перенесенной болезни и т.п.. И все же высокая специфичность реакции может быть обнаружена при ее постановке в динамике методом парных сывороток. Ни анамнестические, ни прививочные или групповые антитела не покажут нарастание титра со второй сывороткой, взятой через 10-12 дней.
5).Тест на фаготипирование по методу Фишера
| Испытуемую суточную бульонную культуру засевают на МПА, затем условно делят чашку на квадраты. В каждый квадрат наносят по одной капле различных фагов. После суточной инкубации в термостате отмечают квадраты, в которых отмечается лизис бактерий. Фаготип бактериальной культуры определяется типом лизирующего ее фага. В квадрат №8 внесен фаг к Salmonella enterica subsp.Typhi |
Вывод___________________________________________________
Какой тест нужно провести, чтобы назначит лечение пациента?___________________________
6). Через месяц после перенесенного заболевания у пациента взяли кровь для выявления Vi-антигена. (Наряду с другими антигенами возбудитель брюшного тифа содержит Vi-антиген, который обеспечивает устойчивость возбудителя к фагоцитозу (способности специализированных клеток организма, фагоцитов, поглощать и переваривать чужеродные частицы, в том числе и микроорганизмы), способствует хронизации инфекции и брюшнотифозному бактерионосительству.)
Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА).
| Титр АГ | 1:10 | 1:20 | 1:40 | 1:80 | 1:160 |
| Результат РНГА | + | + | - | - | - |
Сделайте вывод о состоянии пациента учитывая, что обнаружение антител к Vi-антигену Salmonella enterica subsp.Typhi в титре 1:40-1:80 и выше дает основание подозревать хроническое носительство брюшнотифозных бактерий или развитие иммунной реакции на вакцинацию против брюшного тифа. Отсутствие повышения или низкий титр антител свидетельствуют о том, что возбудителя брюшного тифа нет, или о низкой эффективности вакцинации.
Вывод________________________________________________________________
Профилактика
- Поливакцина TabTe - химическая вакцина. Представляет собой препарат, содержащий в прививочной дозе взрослых (1,5 мл) полных антигенов брюшнотифозного 0,1 мг и паратифозных А и В 0,25 мг, а также 10 ЕС столбнячного анатоксина. Все антигены и столбнячный анатоксин адсорбированы на гидроокиси алюминия. После иммунизации поливакциной через 30-40 дней обязательно проводится дополнительная инъекция столбнячного анатоксина в дозе 0,5 мл.
Вакцина- Вианвак
Вакцина брюшнотифозная полисахаридная жидкая
| Производитель:Россия Состав: раствор капсульного полисахарида, извлеченного из супернатанта культуры Salmonella typhi, очищенного ферментативными и физико-химическими методами; консервант — фенол. |
Пример идентификации неизвестного микроорганизма классическими микробиологическими методами:
Вопросы для самоконтроля:
1. Обоснуйте выбор сред для первичного посева испражнений с целью диагностики бактериальной дизентерии.
2. Назовите виды шигелл, имеющие наибольшее эпидемиологическое значение на современном этапе.
3. Почему бактериальную дизентерию называют болезнью «грязных рук»? Обоснуйте.
4. Обоснуйте выбор методов микробиологической диагностики острой и хронической бактериальной дизентерии.
5. Назовите время выдачи положительного ответа из бак. лаборатории при подозрении на бактериальную дизентерию.
6. Какие свойства лежат в основе дифференциации и идентификации шигелл.
7. Меры неспецифической профилактики бактериальной дизентерии.
Литература:
Учебники:
1.
2. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. – М.: ООО «МИА», 2005. – С. 385-389.
3. Поздеев О. К. Медицинская микробиология / Под ред. акад. РАМН В. И. Покровского. - М.: ГЭОТАР Медицина, 2001. – С. 357-360, 365, 369-371.
Лекции по микробиологии.