Культуральні, морфологічні і тинкторіальні властивості виділених
Культур бактерій
| Характерні ознаки колоній | І тип | II тип | |
| 1. . | Форма | ||
| 2. | Величина | ||
| Рельєф | |||
| 4. | Краї | ||
| 5. | Структура | ||
| 6. | Пігмент | ||
| 7. | Поверхня | ||
| 8. | Консистенція | ||
| 9. | Морфологічні і тинкторіальні властивості властивості властивості бактерій |
Практичне застосування. Характер колонії — є однією з таксономічних ознак бактерій. Крім того, від правильності ходу роботи, а саме відбору ізольованої колонії для вивчення її культуральних властивостей, вивчення її чистоти, а в подальшому правильного пересіву на похилий агар - залежить отримання чистої культури і проведення кінцевої ідентифікації виділеного мікроорганізму.
Тестові завдання.
1. Більшість бактерій розмножуються
А. Спорами
В. Бінарним поділом
С. Мітозом
D. Мейозом
Е. За участю війок
2. Культуральні властивості бактерій – це:
А. Характер росту на твердому поживному середовищі
В. Характер росту на твердому та рідкому поживному середовищі
C. Характер росту у рідкому середовищі
D. Характер росту при доступі кисню
Е. Потреба в певних середовищах і характер росту на них
3. З якою метою на 2-й день виділення чистої культури залишок ізольованої колонії пересівають на похилий агар?
А. Для вивчення біохімічних властивостей
В. Для накопичення чистої культури
С. Для вивчення культуральних властивостей
D. Для вивчення будови бактерій
Е. Для встановлення збудника захворювання
4. Яку функцію несуть пігменти бактерій?
А. Захищають від висихання
В. Сприяють дифузії поживних речовин в клітину
С. Захищають від дії окислюючих речовин
D. Беруть участь у перенесенні генетичного матеріалу
Е. Є акцепторами електронів в оксисно-відновних процесах
5. У 2-й день виділення чистої культури аеробів треба:
А. Вивчити морфо-тинкторіальні властивості збудника і пересіяти колонію на похилий агар
В. Вивчити культуральні властивості ізольованої колонії, пересіяти на похилий агар
С. Вивчити культуральні властивості ізольованої колонії, встановити її чистоту, залишок пересіяти на похилий агар
D. Встановити чистоту ізольованої колонії, залишок пересіяти на похилий агар
Е. Вивчити біохімічні властивості чистої культури
Ситуаційна задача.
Відомо, що пігменти мікроорганізмів є різними за хімічною будовою та виконують багато різноманітних функцій. А. Чому, на Вашу думку, серед мікроорганізмів повітря є багато пігментних форм ? В. Які функції вони виконують? C. за яких умов бактерії виробляють пігменти?
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.46-67.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.64-67.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.63-71.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 45, 59-71.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П., 2002.-С.80--84.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С. 88-99.
Заняття 7.
Тема:Ріст і розмноження мікроорганізмів. Виділення чистих культур бактерій. Ферменти бактерій. Виділення чистих культур анаеробів.
Актуальність. Одним із вирішальних критеріїв для ідентифікації мікроорганізмів за їхнім фенотипом є біохімічна активність. З цією метою використовують диференціально-діагностичні середовища та сучасні тест-системи. Знання біохімічних процесів та методів виявлення дозволяє правильно підібрати такі середовища і тест-системи.
Патогенні види анаеробних мікроорганізмів викликають важкі хвороби у людей. Для правильної та ефективної діагностики цих захворювань потрібно знати властивості анаеробів, середовища, умови та методи культивування.
Мета і завдання. Засвоїти характеристику культуральних властивостей бактерій на похилому агарі та встановити біохімічні властивості бактерій.
Вміти створити анаеробні умови і вибрати середовища для анаеробів. Засвоїти принципи культивування, виділення чистих культур та ідентифікації анаеробів.
Практичні навики:
1. Вміти провести контроль чистоти накопиченої культури на похилому агарі.
2. Оволодіти технікою пересіву бактеріальних культур на “строкатий ряд” для вивчення біохімічних властивостей бактерій.
3. Оволодіти методами посіву для виділення чистих культур анаеробних бактерій.
4. Вміти виявити та оцінити характер росту анаеробних бактерій на поживних середовищах.
Контрольні питання.
1. Ферменти бактерій, їхня класифікація.
2. Контроль чистоти накопиченої культури на похилому агарі.
3. Середовища для виявлення біохімічних властивостей мікроорганізмів.
4. Біохімічні властивості бактерій, як одні з основних ознак ідентифікації.
5. Середовища для культивування анаеробів.
6. Методи культивування анаеробних бактерій.
7. Методи виділення чистих культур анаеробів.
Тестові завдання.
1. Виберіть правильне твердження: “Конститутивні ферменти, це – ферменти, які:
А. Постійно присутні в клітині
В. Синтезуються клітиною при визначених умовах
С. Беруть участь у транспорті поживних речовин у клітину
D. Беруть участь у диханні
Е. Синтезуються клітиною, отримавши субстрат з довкілля
2. Для встановлення чистоти накопиченої культури на похилому агарі потрібно (більше однієї відповіді)?
А. Посіяти у МПБ і поставити у термостат
В. Вивчити макроскопічно
С. Зробити мазок і при мікроскопічному дослідженні виявити мікроби одного виду
D. Вивчити морфологічні та культуральні властивості
Е. Пересіяти на тверде поживне поживне середовище
3. При розщепленні білків утворюються кінцеві продукти: аміак, індол, сірководень. За допомогою якого індикатору можна виявити присутність сірководню?
А. Ацетату свинцю
В. Щавелевої кислоти
С. Лакмусового папірця
D. Бромтимолового синього
Е. Андреде
4.У анаеробів енергетичні процеси забезпечуються за рахунок:
А. Молекулярного кисню
В. Процесів бродіння
С. Процесів денітрифікації
D. Ферментів дихального ланцюга
Е. Цитохромної системи
5. Виберіть поживні середовище для культивування збудників анаеробних інфекцій?
А. Цукрово-кров'яний агар
В. Гіса
С. Кітта-Тароцці
D. Вісмут-сульфітний агар
Е. Вільсона-Блера
Приклади тестів «Крок 1».
До лабораторії надійшов матеріал із рани хворого. Попередній діагноз - газова гангрена. Яким мікробіологічним методом можна встановити видову приналежність збудника?
A. *Бактеріологічним
B. РІА
C. Бактеріоскопічним
D. Алергічним
E. Серологічним
Ситуаційна задача.
При виділенні чистої культури бактерій на певному етапі було проведено пересів виділеної культури на диференціально-діагностичне середовища. При цьому було отримано такі результати: у пробірках з глюкозою, лактозою, манітом - зміна кольору середовища з жовтого на червоний та наявністю бульбашок газу в поплавках, середовище з сахарозою забарвлення не змінило; у пробірках з МПБ – один індикаторний папірець порожевів. А. Які властивості виділеної культури описано? В. Які ще дослідження проводять на цьому етапі? С. Оцініть інформативність отриманих результатів та зробіть висновок.
Зміст і хід заняття:
Робота 1. Виділення чистої культури бактерій, 3-й день дослідження. Вивчення культуральних властивостей бактерій на похилому агарі та дослідження чистоти накопичуваної культури.
Принцип дослідження. Полягає у вивченні культуральних властивостей на похилому агарі, а саме однорідного росту виділеної культури (макроскопічне дослідження культури) та перевірка чистоти культури (мікроскопічне дослідження).
Хід роботи:а) вивчити характер росту бактерій: золотистого і білого стафілококів, сарцини, кишкової палички, синьогнійної палички, протею, антракоїду в демонстраційних посівах.
б) вивчити особливості росту виділеної культури на агарі та звернути увагу на однорідність росту. Приготувати мазок, зафарбувати його за Грамом. При мікроскопічному дослідженні переконатись, що культура чиста і в мазку є бактерії одного морфологічного типу. За наявності інших бактерій культура є нечистою і подальшому дослідженню не підлягає.
Практичне значення.Виявлення неоднорідного росту або росту поза штрихом піддає сумніву подальше дослідження культури. При проведенні мікроскопічного дослідження чистої культури, наявність однакової морфології, розмірів та тинкторіальних властивостей вказує, що культура чиста і підлягає подальшому дослідженню.
На цьому етапі вказані дослідження дають орієнтовну оцінку про виділену культуру, але в окремих випадках на їхній основі можна зробити висновок про вид виділених бактерій.
Робота 2. Вивчення методів виявлення біохімічної активності бактерій, 3-й день дослідження. Дослідження біохімічних властивостей виділеної культури.
Принцип дослідження.Базується на вибірковій ферментативній здатності кожного виду бактерій. Для цього виділену культуру культивують на диференціально-діагностичних середовищах або тест-системах, у складі яких є різні вуглеводи і білкові субстрати, що дає змогу встановити цукролітичні та протеолітичні властивості бактерій за продуктами ферментації.
Хід роботи:а) вивчити склад середовища Гіса, виявити зміни у пробірках, викликані бактеріями - розклад вуглеводів до кислоти (зміна кольору індикатора), газоутворення - бульбашки газу у поплавках або в напіврідкому середовищі. Виявити процес розкладу білків з утворенням кінцевих продуктів - сірководню (почорніння індикаторного папірця із ацетатом свинцю), індолу (почервоніння індикаторного папірця із щавлевою кислотою), аміаку (зміна кольору лакмусового папірця). Вивчити тест-системи для біохімічної ідентифікації бактерій ("Стафілотест", "Стрептотест", "Ентеротест", СІП та ін). Звернути увагу на форму випуску та термін придатності. Вивчити правила користування ними.
б) дотримуючись правил асептики, пересіяти петлею культуру з похилого агару в середовище Гіса для визначення здатності бактерій розкладати вуглеводи (глюкозу, лактозу, маніт). Пересіяти чисту культуру у пробірку з МПБ. Після посіву закріпити корком в пробірці індикаторні папірці для визначення продуктів розщеплення білків (сірководню, індолу).
Практичне значення.Встановлення біохімічної активності мікроорганізмів дозволяє визначити вид збудника, як етіологічного чинника захворювання.
Робота 3.Вивчення особливостей культивування анаеробних мікроорганізмів та етапів виділення чистих культур анаеробів.
Принцип дослідження.Полягає у створенні анаеробних умов для культивування різними методами. Це досягається підбором спеціальних поживних середовищ з низьким окисно-відновним потенціалом та шаром вазелінової олії на поверхні; використанням речовин, що поглинають кисень та редукуючих речовин; посівом у високий стовпчик середовища; використанням анаеростатів, мікроанаеростатів, пакетів з газовою сумішшю «Gas Box»; одночасним культивуванням аеробів та анаеробів.
Хід роботи:вивчити зразки середовищ для культивування анаеробних бактерій: Кітта-Тароцці, Вільсона-Блера, молоко, цукровий агар. Вивчення будови мікроанаеростата, дослідити посіви анаеробів у трубках Віньяль-Вейона, на чашках за методом Фортнера, на кров'яному агарі після культивування в мікроанаеростаті, охарактеризувати колонії.
Дослідити демонстраційні посіви, вивчити схемидосліджень за допомогою таблиць. Скласти схему виділення (методи Цейслера та Вейнберга) та ідентифікації чистих культур анаеробів.
Практичне значення.Послідовне виконання всіх етапів виділення чистих культур анаеробівдозволяє продовжити подальше дослідження для встановлення виду збудник .
Складання протоколів.Описати культуральні властивості бактерій в демонстраційних посівах на похилому агарі (робота 1). Описати і замалювати зміни у середовищах при дії бактерій (робота 2). Охарактеризувати культуральні та морфологічні властивості виділеної культури, зробити висновок про її чистоту (робота 3). Описати хід роботи, вказати, на які середовища і з якою метою пересіяна чиста культура (робота 4). Охарактеризувати середовища та методи культивування анаеробів (робота 5). Скласти схеми виділення чистих культур анаеробів (робота 6).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-C.50-51, 54-55, 63-64.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2004.-C.53-54, 661-62.
3.Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. - С.65-71.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Т.: Укрмедкнига, 2004. - С. 64-75.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П.,2002.-C.66-80.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія / За редакцією В.П. Широбокова. – Вінниця., Нова книга, 2011. – с.77-95.
Заняття 8.
Тема:Виділення чистих культур бактерій. Фактори патогенності мікроорганізмів. Біологічний метод в мікробіології.
Актуальність.Ідентифікація виділеної чистої культури мікроорганізмів – заключний етап бактеріологічного дослідження. Критерії ідентифікації, способи і методи виявлення є базисними знаннями при вивченні кожного виду мікроорганізмів.
Експериментальне відтворення інфекційного процесу дозволяє вивчити та зрозуміти фізіологію патогенних мікроорганізмів, патогенез та епідеміологію інфекційних хвороб, а також ефективність протимікробних та імунологічних препаратів іn vivo. Експериментальний (біологічний) метод дослідження застосовують при діагностиці захворювань, спричинених мікроорганізмами, що не культивуються іn vitro.
Мета і завдання.Ознайомитись з принципами ідентифікації бактеріальних культур за вимогами «Визначника бактерій». Засвоїти основні критерії ідентифікації чистих культур бактерій. Оцінити біохімічні властивості культур у посівах на диференційно-діагностичних середовищах і у тестових системах.
Вивчити експериментальний метод дослідження і його призначення. Вивчити фактори вірулентності, методи виявлення; поняття “інфекція”, “інфекційний процес” та форми інфекції.
Практичні навики.
1. Засвоїти критерії ідентифікації чистих культур аеробів.
2. Визначити вид виділеної культури бактерій на основі проведених досліджень.
3. Ознайомитись з правилами розтину трупа тварини та первинної обробки матеріалу при експериментальному дослідженні.
4. Оволодіти методом мікроскопічного дослідження мазків – відбитків.
5. Оволодіти методом посіву матеріалу з органів трупа тварини.
6. Провести облік та зробити висновок про патогенність досліджуваних штамів стафілококів.
7. Засвоїти методи вивчення факторів вірулентності, облік результатів та оцінку вірулентності культури.
Контрольні питання.
1. Основні ознаки, за якими визначають вид бактерій.
2. Поняття про біовар, серовар, фаговар.
3. Критерії ідентифікації чистої культур аеробів.
4. Визначення поняття вірулентності та патогенності. Одиниці вірулентності.
5. Мікробні токсини, генетичний контроль, класифікація та властивості, методи одержання для медичних потреб.
6. Інвазивність та агресивність мікроорганізмів.
7. Фактори патогенності мікробів ферментної природи.
8. Дати визначення поняття “інфекція”. Ознаки інфекційного захворювання.
Форми інфекції.
9. Шляхи поширення мікробів та їх токсинів у організмі.
10. Експериментальний метод у мікробіології та його значення.
11. Способи зараження та мікробіологічне дослідження заражених тварин.
Тестові завдання.
1. Який продукт реакції вказує на здатність бактерій розщеплювати вуглеводи?
А. Кислота
В. Аміак
С. Індол
D. Сірководень
Е. Пептон
2. Який висновок про біохімічні властивості чистої культури треба зробити, якщо у пробірці з МПБ один з індикаторних папірців змінив колір на рожевий?
А. Чиста культура розщеплює білки з утворенням сірководню
В. Чиста культура розщеплює вуглеводи з утворенням кислоти і газу
С. Чиста культура не ферментує білки
D. Чиста культура не ферментує вуглеводи
Е. Чиста культура ферментує білки з утворенням індолу
3. За хімічною природою ендотоксини є:
А. Вуглеводами
В. Ліпополісахаридами
С. Білками
D. Ліпідами
Е.Неорганічними речовинами
4. Випадок повторного зараження тим самим видом збудника після повного одужання називається:
А. Реінфекція
В. Рецидив
С. Суперінфекція
D. Хронічна інфекція
Е. Латентна інфекція
5. Яка структура бактеріальної клітини захищає збудник від фагоцитозу та дії антитіл макроорганізму і є важливим фактором патогенності?
А. Клітинна стінка
В. Спора
С. Капсула
D. Екзотоксин
Е. Мікробні ферменти
Приклади тестів «Крок 1».
1. Пацієнт одужав після перенесеної дизентерії Зонне і повторно заразився цим же збудником. Як називається така форма інфекції?
A. *Реінфекція
B. Суперінфекція
C. Персистуюча інфекція
D. Хронічна інфекція
E. Рецидив
2. У дитини з підозрою на дифтерію з зіву виділена чиста культура мікроорганізмів та вивчені їх морфологічні, тинкторіальні, культуральні та біохімічні властивості, які виявилися типовими для збудників дифтерії. Яке дослідження необхідно ще провести для видачі висновку про те, що виділена патогенна дифтерійна паличка?
A. *Визначення токсигенних властивостей
B. Визначення протеолітичних властивостей
C. Визначення властивості розщеплювати крохмаль
D. Визначення цистиназної активності
Е. Визначення уреазної активності
3. У хворого лікар діагностував гостру гонорею. З анамнезу стало відомо, що раніше він переніс гонорею і вилікування було повним. До якої категорії інфекцій можна віднести це нове захворювання?
A. *Реінфекція
B. Суперінфекція
C. Вторинна інфекція
D. Аутоінфекція
E. Рецидив
4. Людина, яка проживала в ендемічному вогнищі, перехворіла 3-денною малярією. Через півтора року після переїзду в іншу місцевість захворіла малярією знову. Яка найбільш вірогідна форма цього захворювання?
A. *Рецидив
B. Реінфекція
C. Суперінфекція
D. Персистуюча інфекція
E. Вторинна інфекція
5. Поворотний тиф, що викликається B. сaucasica, зустрічається лише на певних територіях, де є переносник кліщ роду Alectorobius. Як можна назвати таку інфекцію?
A. *Эндемічною
B. Экзотичною
C. Спорадичною
D. Пандемічною
E. Эпідемічною
6. У дитини, що одужує після кору, розвинулася пневмонія, викликана умовно-патогенними бактеріями. Яка найбільш ймовірна форма цієї інфекції?
А. Персистуюча інфекція
В. Реінфекція
С. *Вторинна інфекція
D. Суперінфекція
Е. Госпітальна інфекція
Ситуаційна задача.
У баклабораторії з гною фурункула було виділено на кров’яному та жовтково-сольовому агарі золотистий стафілокок. А. Які методи мікробіологічної діагностики дозволили встановити вид збудника? В. На основі яких властивостей зроблено висновок. С. Які фактори патогенності було виявлено в процесі виділення збудника?
Зміст і хід заняття:
Завдання 1.Проведення обліку біохімічних властивостей виділеної чистої культури бактерій.
Принцип дослідження. Полягає в реєстрації характерних змін на диференційно-діагностичних середовищі Гіса, МПБ, куди були посіяні культури мікроорганізмів.
Хід роботи:Виявити здатність виділеної культури розкладати вуглеводи до кислоти (зміна кольору індикатора - умовне позначення "К"), або до кислоти і газу (умовне позначення "КГ"). Відсутність змін - умовне позначення " - ". Виявити утворення кінцевих продуктів розпаду білків - сірководню, аміаку, індолу за зміною кольору відповідних індикаторних папірців.
У бульйонній культурі відзначити характер росту: суцільне помутніння, осад і його особливості, наявність кільця, плівки, пігменту.
Практичне значення.Чітке виконання усіх попередніх етапів виділення чистої культури дозволяє отримати достовірні результати біохімічних властивостей виділеної культури.
Завдання 2. Проведення ідентифікації виділеної чистої культури бактерій.
Принцип дослідження. Полягає в ідентифікації виділеної культури за морфотинкторіальними, культуральними та біохімічними властивостями.
Хід роботи:Властивості культури, виявлені на заняттях №5 - №8 записати в таблицю. Порівняти властивості культури з даними "Визначника бактерій", встановити родову і видову назву бактерій та записати її латинськими літерами.
| Вид бакте-рій | Морфоло-гічні власти-вості | Культуральні властивості | Біохімічні властивості | |||||
| МПБ | МПА | Глюкоза | Лактоза | Маніт | Сірково-день | Індол | ||
Практичне значення дослідження. Встановлення комплексу властивостей виділеної культури дозволяє визначити вид збудника, як етіологічного чинника захворювання.
Завдання 3.Експериментальний метод діагностики інфекційних хвороб. Розтин трупа тварини, що загинула після зараження культурою бактерій.
Принцип методу.Полягає у дослідженні змін в організмі експериментальної тварини спричинених інфекцією
Хід роботи:Дослідження зовнішніх покривів. Оглянути труп, відмітити зміни зовнішніх покривів (наявність виразок, випадіння шерсті, зміни кольору шкіри і т. ін.). Зафіксувати труп тварини на спеціальному столику, поклавши її на спину і розтягнувши кінцівки в сторони. Обробити шкіру спиртом і розрізати по середній лінії живота від нижньої щелепи до лона, а потім зробити розрізи до лапок. Відпрепарувати шкіру. Визначити зміни в підшкірній клітковині (розширення судин, крововиливи, набряки стан лімфатичних вузлів). При наявності змін з боку останніх, зробити посіви на поживні середовища і приготувати препарати – відбитки (предметним склом торкнутися надрізаної ділянки лімфовузла). Розтин і дослідження грудної порожнини. Захопивши пінцетом мечеподібний відросток, зробити під ним надріз і ножицями перерізати з обох сторін ребра у місцях їх з’єднання з грудиною. Відкинути клапоть грудини доверху. Оглянути грудну порожнину, відмітити наявність чи відсутність рідини в ній. Оглянути серце, легені. Посіяти кров із серця. Для цього припекти верхівку серця розжареним скальпелем і, притримуючи серце пінцетом, через пропечену ділянку проколоти серце. Пастерівською піпеткою взяти кров, посіяти в пробірку з МПБ і на сектор МПА. З решти крові, що залишилася в піпетці, зробити мазок. Результати огляду органів грудної порожнини і всі спостереження занести у протокол. Зробити посіви і мазки – відбитки з тканин легень, серця, плевральної рідини. Матеріал для посівів із органів беруть таким чином: припікають поверхню органу і на цьому місці роблять розріз, притримують відрізаний шматочок пінцетом і торкаються поверхнею розрізу до поживного середовища (МПА). Для посіву на бульйон зшкрябують матеріал стерильною петлею. Роблять мазки - відбитки з органів декілька разів торкаючись поверхнею розрізу до предметного скла. Мазки фіксують, фарбують за методом Грама. Розтин і дослідження черевної порожнини. Піднявши пінцетом черевну стінку. Розрізати її від діафрагми до лобка (при цьому не пошкодити кишки). Утворені м’язові клапті відвести убік. Посіяти ексудат у МПА та МПБ. Оглянути і відмітити в протоколі стан органів черевної порожнини (колір, зміни розмірів, консистенцію, вогнища ураження). Вирізати шматочки органів, зробити посіви (на МПБ, МПА) і мазки – відбитки. Мазки – відбитки зафарбувати за методом Грама, мікроскопувати і замалювати. Посіви підписати і поставити в термостат до наступного заняття. При наявності росту у МПБ та на МПА вивчити під мікроскопом мазки з колоній і бульйоної культури. Замалювати і зробити висновок.
Практичне значення.Застосування експериментального методу дає змогу виділити мікроорганізм із досліджуваного матеріалу, коли збудник не можна виявити методом посіву; визначити ступінь токсичності та фактори вірулентності; вивчити ефективність протимікробних і імунологічних препаратів; експериментально відтворити деякі інфекції (інфекційний процес).
Завдання 2. Виявлення факторів вірулентності бактерій.
Принцип дослідження.Базується на виявленні ферментів, як факторів вірулентності патогенних мікроорганізмів, шляхом посіву на спеціальні середовища.
Хід роботи:а)виявлення бактеріальних гемолізинів. Штам стафілококу №1, виділений від хворого ангіною , штам №2 – зі шкіри здорової людини. Обидва штами пересіяні на тверде середовище з вмістом 3% еритроцитів кроля. Визначити який із штамів продукує гемо лізини;
б) визначення лецитиназної активності бактерій. Обидва штами стафілококів посіяно на тверде середовище з яєчним жовтком. Виявити лецитиназно-позитивний штам;
в) виявлення плазмокоагулази у бактерій. Колонії штамів №1 та №2, що виросли при температурі 370С протягом 12 год., засіяно у пробірки з цитратною кролячою плазмою. Пробірки витримано в термостаті при температурі 370С протягом 4 год. Встановити, який із цих штамів є плазмокоагулюючим;
г) визначення бактеріальної гіалуронідази. У 6 пробірок внесено робочу дозу гіалуронової кислоти по 0,2 мл., дистильовану воду і фільтрат бульйоної культури за схемою:
| Пробірки | ||||||
| Гіалуронова кислота | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 | 0,2 |
| Дистильована вода | 0,3 | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,7 | 0,8 |
| Фільтрат бульйонної культури стафілокока | 0,5 | 0,4 | 0,3 | 0,2 | 0,1 | _ |
Після витримування пробірок у термостаті протягом 15 хв., а потім у холодильнику протягом 2 хв. у кожну з них внесено по 2 краплі 2% розчину оцтової кислоти. Встановити за ступенем руйнування гіалуронової кислоти гіалуронідазну активність вказаних штамів стафілококів. Зробити висновок про патогенність досліджуваних штамів стафілококів.
Практичне значення.Додаткове дослідження факторів вірулентності допомагає встановити вид збудника та міру його патогенності.
Завдання 3. Вивчення капсулоутворення бактерій в організмі тварин.
Принцип дослідження.Виявлення відповідної структуриу мікроорганізмів при мікроскопічному дослідженні
Приготування та мікроскопування мазків з рідкого середовища та з трупа тварини, яка була заражена капсульними бактеріями.
Хід роботи: Дослідити мікроскопічно 2 мазки: 1) мазок №1 – приготований із бульйонної культури пневмокока; 2) мазок №2 - відбиток органів тварини, що загинула після зараження культурою пневмокока. Обидва мазки забарвленні метиловим синім. Мікроскопічна картина: в мазку №1 ланцетоподібні диплококи голубого кольору, в мазку №2 - на фоні овальних клітин органу, забарвлених у голубий колір, видно голубі ланцетоподібні диплококи, оточенні безколірною капсулою.
Практичне значення.Виявлення капсули у бактерій з трупного матеріалу вказує на їхню вірулентність, без капсульні варіанти тих самих видів невірулентні.
Завдання 4.Визначення ДЛМ (мінімальна летальна доза) дифтерійного токсину патогенних мікроорганізмів.
Принцип дослідження.Полягає у встановленні мінімальної кількості токсину, що вбиває чутливих тварин стандартної маси і віку протягом певного проміжку часу (загиблих тварин має бути не менше 95%).
Хід роботи:Вирахувати ДЛМ дифтерійного токсину для морської свинки, користуючись числовими результатами досліду.
| Кількість введеного токсину (1:1000) | 0,4мл | 0,2мл | 0,1мл | 0,05мл | (конт-роль) |
| Строк загибелі тварин | 2- й день | 3- й день | 4- й день | жива | жива |
Практичне значення.Полягає у виявленні мікроорганізмів з високою вірулентністю, які можуть викликати захворювання і смерть у дуже мізерних дозах.
Завдання 5. Вивчення механізмів передачі інфекційних хвороб.
Принцип дослідження.Полягає у засвоєнні способів зараження відповідним видом інфекції, а також способів проникнення та поширення патогенних мікроорганізмів в організм людини.
Хід роботи:скласти таблицю “ Резервуари, джерела, механізми та шляхи передачі інфекції”.
Практичне значення.Розуміння елементів епідемічного процесу необхідно для вибору матеріалу для проведення мікробіологічних досліджень (клінічний матеріал, переносники, фактори передачі, тощо).
Складання протоколів:Записати результати біохімічної активності виділеної чистої культури (завдання 1). Заповнити таблицю, записати висновок про вид виділеної чистої культури, вказавши критерії, за якими вона ідентифікована (завдання 2). Записати зміст робіт та зробити відповідні висновки (завдання 3, 4), Скласти таблицю (завдання 5).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-C.50-51, 54-55, 63-64.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2004.-C.53-54, 661-662.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. - С.65-71.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Т.: Укрмедкнига, 2004. - С. 64-70,100-111.
5. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. -С.-П.,2002.- C. 124-135.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія / За редакцією В.П. Широбокова. – В.: Нова книга, 2011. – с. 61-63, 77-95, 177-194, 324.
Заняття 9.
Тема: Явище антагонізму мікроорганізмів. Мікробіологічні основи антимікробної хіміотерапії.
Актуальність.Застосування антимікробної хіміотерапії, яка є складовою лікування інфекційних та ряду соматичних захворювань вимагає вивчення її мікробіологічних основ.
Мета і завдання. Вивчення явища антагонізму мікроорганізмів, джерел отримання антибіотиків та хіміотерапевтичних препаратів, принципів їх класифікації. Оволодіння методами визначення антимікробних властивостей антибіотиків, визначення чутливості мікробних культур до них.
Контрольні питання.
1. Явище антагонізму мікроорганізмів.
2. Способи виявлення антагонізму мікроорганізмів.
3. Основні групи хіміотерапевтичних речовин та механізм їх дії.
4. Принципи класифікації антибіотиків за спектром дії, за джерелами та способами отримання, за механізмом дії.
5. Поняття про бактеріостатичну та бактерицидну дію антибіотиків.
6. Спектр та механізм дії антибіотиків.
7. Фітонциди та їх значення.
8. Основні принципи раціональної та комбінованої хіміотерапії.
9. Методи визначення чутливості бактерій до антибіотиків.
10. Значення мікробіологічних досліджень в етіопатогенетичному лікуванні хворих.
11. Розвиток промисловості по виробництву хіміотерапевтичних препаратів.
Практичні навики.
1. Оволодіти методами визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків шляхом постановки антибіотикограми за методом паперових дисків.
2. Вміти визначати мінімальну антимікробну концентрацію хіміопрепарату за методом серійних розведень.
3. Вміти проаналізувати результати визначення чутливості конкретного штаму мікроорганізмів до антимікробних засобів.
Тестові завдання.
1. Які з антибіотиків мають вузький спектр дії і не впливають на грамнегативні палички:
А. Природні пеніциліни
В. Цефалоспорини II покоління
С. Тетрацикліни
D. Аміноглікозиди
Е. Поліміксини
2. У пацієнта після тривалого вживання антибіотиків розвинувся дисбактеріоз кишечника. Які препарати слід призначити для відновлення нормальної мікрофлори?
А. Еубіотики
В. Сульфаніламіди
С. Інтерферон
D. Протигрибкові препарати
Е. Цефалоспорини
3. Який з названих антибіотиків буде руйнуватися ферментом бета-лактамазою?
А. Гентаміцин
В. Рифампіцин
С. Еритроміцин
D Тетрациклін
Е. Бензилпеніцилін
4. Сульфаніламідні препарати відносяться до антиметаболітів:
А. Нікотинової кислоти
В. Фолієвої кислоти
С. Тіаміну
D. Токоферолів
Е. Нуклеозидів
5. Який з названих хіміотерапевтичних препаратів відноситься до фторованих оксихінолонів?
А. Бісептол
В. Сульфодіметоксин
С. Норфлоксацин
Д. Палін
Е. Фурагін
Приклади тестів «Крок 1».
1. У хворого на туберкульоз після тривалого лікування з’явились шум та дзвін у вухах, зниження слуху, висипи на шкірі, набряк слизових оболонок і порушилась координація рухів. Після відміни препарату стан хворого значно покращився. Який препарат приймав хворий?
А. *Стептоміцину сульфат
В. Бепаск
С. Етамбутол
D. Ізоніазид
Е. Рифампіцин
2. Для лікування урогенітальних інфекцій використовують хінолони – інгібітори ферменту ДНК – гірази. Який процес порушується під дією хінолонів у першу чергу?
А. Ампліфікація генів
В. *Реплікація
С. Зворотня транскрипція
D. Репарація
Е. Рекомбінація генів
3. З гнійної рани хворого виділено патогенний стафілокок та визначено його чутливість до антибіотиків: пеніцилін – зона затримки росту 8мм, оксациклін – 9мм, ампіцилін – 10мм, гентаміцин – 22мм, лінкоміцин – 11мм. Який антибіотик необхідно вибрати для лікування хворого?
А. Пеніцилін
В. Оксациклін
С. Ампіцилін
D. *Гентаміцин
Е. Лінкоміцин
4. До стоматолога звернулася мати зі скаргами на руйнування зубів у дитини 2-х років. Під час огляду молочні зуби деформовані, уражені карієсом, у шийки коричнева облямівка. З анамнезу встановлено, що мати під час вагітності приймала антибіотики без контролю лікаря. Вкажіть антибіотики якої групи, що мають найбільш виражену тератогенну дію, могла приймати мати?
А. Аміноглікозиди
В. Пеніцилін
С. Макроліди
D. *Тетрацикліни
Е. Цефалоспорини
5. Для лікування бактеріальної пневмонії було призначено бензилпеніциліну натрієву сіль. Який механізм антимікробної дії препарату?
A.*Пригнічення синтезу клітинної стінки мікроорганізмів
B. Пригнічення внутрішньоклітинного синтезу білка
C. Пригнічення активності холінестерази
D. Пригнічення SH-груп ферментів мікроорганізмів
E. Антагонізм з параамінобензойною кислотою
Ситуаційна задача.
Із гнійноїранивиділеноштам стафілококу, який за результатами антибіотикограми виявився стійким до бензилпеніциліну та цефалоспоринів І-го покоління, однак чутливим до амоксиклаву. А. Передбачте механізм розвитку резистентності такого штаму. В. Що є основою інгібітор-захищених бета-лактамів? С. Запропонуйте антибіотики інших груп, до яких цей штам може мати чутливість?
Зміст і хід заняття.
Робота 1. Визначення антагоністичної дії мікроорганізмів.
Принцип дослідженняґрунтується на виявленні зон затримки росту одних бактерій іншими та встановленні розмірів цих зон.
Хід роботи: Облік результатів досліду визначення антагоністичної дії синьогнійної палички на інші види бактерій. У чашці Петрі з МПА засіяно секторами епідермальний і золотистий стафілококи, клебсієла та кишкова паличка. У центрі кожного сектора посіяна культура синьогнійної палички. Виявити наявність і розміри зон затримки росту, зробити висновок про антагоністичну дію синьогнійної палички на інші види бактерій.
Практичне значення.Явищеантагонізму мікроорганізмів є передумовою створення антибіотиків. Вивчення його є підґрунтям для розуміння механізму дії ряду антибактеріальних засобів.
Робота 2.Вивчення чутливості бактерій до рослинних фітонцидів.
Принцип дослідженняґрунтується на визначенні дії парів фітонцидів часнику та цибулі на кишкову паличку.
Хід роботи: У чашку Петрі з МПА засіяти газоном кишкову паличку. На внутрішню поверхню кришки чашки нанести 0,5 г свіжорозтертого часнику або цибулі. Посів поставити в термостат на 24 год., облік результатів досліду провести на наступному занятті.
Практичне значення. Розробка та застосування лікарських засобів на основі фітонцидів є доцільним при наявності протипоказів до вживання синтетичних антимікробних засобів. Слід враховувати цілющі властивості рослин при плануванні зелених насаджень, облаштуванні рекреаційних зон на територіях, де розташовані лікарняні заклади, або підприємства, що генерують токсичні викиди у атмосферу.
Робота 3. Визначення чутливості бактерій до антибіотиків. Постановка антибіотикограми (диско-дифузійний метод, метод Кірбі-Бауера).
Хід роботи: У чашки Петрі з МПА засіяти газоном чисті культури кишкової палички, епідермального стафілокока, клебсієли. Стерильним пінцетом на поверхню посіву нанести стандартні диски з антибіотиками. Облік результатів досліду провести на наступному занятті.
Практичне значення.Мікробіологічні основи протимікробної хіміотерапії покладено в основу етіотропного лікування переважної більшості захворювань, що спричиняються інфекційними агентами бактеріальної природи.
Робота 4. Складання схеми класифікації антимікробних засобів.
Принцип методу.Мішенню дії хіміопрепарату на конкретний мікроорганізм є структура певної хімічної природи.
Хід роботи: Використовуючи таблиці та демонстраційні вітрини, скласти схему класифікації антимікробних засобів, керуючись механізмом і спектром дії.
Практичне значення.Хіміотерапевтичні препарати є складовою лікування надзвичайно великої кількості інфекційних та ряду соматичних захворювань, тому вивчення спектру їх дії представляє неабиякий інтерес для студента-медика.
Робота 5. Визначення мінімальної концентрації хіміопрепарату.
Принцип методуполягає у встановленні найменшої концентрації антимікробного засобу, яка є ефективною, тобто не дає ознак росту мікроорганізму (дифузного помутніння всього середовища).
Хід роботи: Виставлено кілька рядів пробірок з МПБ, які містять хіміотерапевтичний препарат (налідіксонова кислота) у спадаючих концентраціях. У пробірки засіяні культури клебсієли, кишкової палички, синьогнійної палички. Визначити мінімальну концентрацію препарату, яка пригнічує кожен вид мікроорганізмів, встановити найбільш і найменш чутливий вид.
Практичне значення.Етіотропне лікування багатьох захворювань, що спричиняються бактеріями, призначається на основі результатів визначення чутливості до хіміотерапевтичних засобів. У багатьох ситуаціях дуже важливим є встановлення мінімальної концентрації хіміопрепарату, яка дає ефект.
Робота 6. Визначення хіміотерапевтичного індексу.
Хід роботи: За числовими даними, запропонованими викладачем (максимальна переносима доза і мінімальна терапевтична доза) встановити хіміотерапевтичний індекс різних препаратів.
Практичне значення полягає у складанні висновку про можливість застосування хіміопрепарату як лікарського засобу з урахуванням його токсичної дії на організм людини.
Складання протоколів.Записати хід виконання робіт 1, 2, 3.Описати: результати досліду та висновки (робота 1), хід і результати роботи 5, висновки роботи 6.
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.160 – 182.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.124 -136 .
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.198 - 211.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 135 - 147.
5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 113 - 124.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.161 - 176.
Заняття 10.
Тема:Імунітет. Види резистентності організму до збудників інфекційних захворювань. Фактори неспецифічного захисту організму. Імунна система організму.
Актуальність.Людину оточує величезна кількість різноманітних біологічних об’єктів (мікроорганізмів, речовин) чужорідних до її організму, тож еволюційно у неї розвилися різні засоби та механізми захисту проти цих сторонніх агентів, які у сукупності називаються резистентністю організму. Розуміння механізмів першої лінії захисту організму від інфекції (неспецифічна реакція) та другої лінії захисту - імунологічні фактори, необхідне при дослідженні патогенетичних основ будь-якого захворювання.
Мета і завдання. Засвоїти основні знання про: механізми, фактори неспецифічної резистентності організму людини; показники оцінки неспецифічного захисту організму; органи та клітини імунної системи.
Контрольні питання.
1. Визначення поняття “імунітет”. Види імунітету.
2. Фактори і механізми неспецифічного імунного захисту організму.
3. Клітинно-тканинні механізми: бар’єрні та антимікробні властивості шкіри та слизових оболонок, рідин організму; нормальна мікрофлора тіла, запалення, лихоманка.
4. Фагоцитоз. Фагоцитуючі клітини. Стадії фагоцитозу. Завершений та незавершений фагоцитоз. Опсоніни.
5. Оцінка неспецифічної резистентності організму (фагоцитарне число, показник завершеності фагоцитозу, кількість активних фагоцитів, абсолютний фагоцитарний показник, опсоно-фагоцитарний індекс). Методи визначення.
6. Кілінгова система організму людини. Природні кілери та їх роль в імунному нагляді. Реакції відторгнення трансплантату.
7. Гуморальні механізми неспецифічного захисту: система комплементу, лізини, інтерферони, лізоцим, пропердин, фібронектин, бета-лізин, еритрин.
8. Центральні органи імунної системи, їх будова та функції.
9. Периферійні органи імунної системи, їх будова та функції.
10. Генез імунокомпетентних клітин.
11. Характеристика Т-лімфоцитів та їх субпопуляцій.
12. Характеристика В-лімфоцитів та їх популяцій.
13. Макрофаги та їх функції.
Практичні навики.
Навчитись: виявляти клітини-фагоцити; досліджувати активність лізоциму слини та визначати титр комплементу; оцінювати стан неспецифічного імунного захисту за: розрахунком фагоцитарного числа, опсоно-фагоцитарного індексу, завершеністю фагоцитозу.
Тестові завдання.
1. В тексті завдання вказані фактори, що беруть участь у формуванні стійкості організму до патогенних мікрорганізмів. 1. Фагоцитоз. 2. Система комплементу. 3. Антитіла. 4. Лізоцим. 5. Імунні Т-кіллери. 6. Сенсибілізовані Т-лімфоцити. 7. Трансформовані під впливом антигену В-лімфоцити. Які з них відносяться до факторів неспецифічної резистентності?
А. 1, 2, 4
В. 2, 6, 7
С. 1, 4, 6
D. 3, 5, 7
E. 2, 4, 6
2. Як називається здатність організму протистояти дії генетично чужих субстанцій за допомогою механізмів, що виробилися конкретним видом в процесі еволюції?
А. Неспецифічна резистентність
В. Імунологічна реактивність
С. Імунологічна пам’ять
D. Імунологічний нагляд
Е. Імунологічна толерантність
3. Яка клітина імунної системи є центральною?
А. Еритроцит
В. Моноцит
С. Нейтрофіл
D. Лімфоцит
Е. Лейкоцит
4. Виберіть центральний орган імунної системи:
А. Селезінка
В. Кров
С. Вилочкова залоза
D. Печінка
Е. Лімфатичний вузол
5. З яких клітин походять лімфоцити?
А. Еритроцитів
В. Епітеліальних
С. Стовбурових
D. Ентероцитів
Е. Фагоцитів
Ситуаційна задача.
В хірургічний кабінет поліклініки звернувся пацієнт з підвищеною температурою тіла та нагноєною раною на лівому передпліччі. При огляді лікар відмітив набряк, почервоніння та болючість ураженої ділянки руки. Ним було забрано гній для мікроскопічного дослідження. А. Описати мікроскопічну картину препарату. В. Які механізми беруть учать у неспецифічному захисті організму? С. Які фактори захисту діють в означеному випадку?
Приклади тестів «Крок 1».
1.Для прискорення загоєння рани слизової оболонки в ротовій порожнині хворому призначено препарат, який являє собою термостабільний білок, що міститься у людини в сльозах, слині, грудному молоці, а також його можна виявити в свіжознесеному курячому яйці. Відомо, що він являє собою фактор природної резистентності організму і має назву:
A.*Лізоцим
B. Комплемент
C. Інтерферон
D. Інтерлейкін
E. Іманін
2. При обстеженні хворого була виявлена недостатня кількість імуноглобулінів. Які з перелічених клітин імунної системи виробляють імуноглобуліни?
А. *Плазматичні
В. Т-хелпери
С. Т-кілери
D.Т-супресори
Е. Плазмобласти
Зміст і хід заняття:
Робота 1. Вивчення видів резистентноті організму до збудників інфекційних хвороб.
Хід роботи. Розглянути за допомогою демонстраційних таблиць види імунітету.
Практичне значення. Вивчення ознак імунної відповіді того чи іншого типу використовується в діагностиці, лікуванні та профілактиці інфекційних захворювань.
Робота 2. Вивчення явища фагоцитозу.
Принцип роботи.Мікроскопічне дослідження гною, виділень від хворого дозволяє виявити фагоцити та фагоцитовані і нефагоцитовані клітини.
Хід роботи. Вивчити фази фагоцитозу: таксис (наближення лейкоциту до мікроорганізму); адсорбція (осідання мікроба на лейкоциті); проникнення (захоплення мікроба лейкоцитом); лізис (розчинення мікроорганізму в лейкоциті) та незавершений фагоцитоз, використовуючи демонстраційні таблиці. Розглянути таблиці із зображенням незавершеного фагоцитозу туберкульозних та бруцельозних бактерій. Мікроскопіювати в імерсійній системі мазки гною із уретри хворого на гонорею. Мікроскопічна картина: скупчення диплококів у лейкоцитах.
Практичне значення. Дослідження гною та виявлення фагоцитів свідчить про запальний процес активного клітинного неспецифічного захисту організму.
Робота 3. Оцінка фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів.
Принцип оцінкибактерицидної активності фагоцитів полягає у виявленні життєздатність бактерій, які після фагоцитозу опиняються в цитоплазмі лейкоцитів (незавершений фагоцитоз) та кількісні показники за підрахунком фагоцитуючих клітин.
Хід роботи. Суспензію культури стафілококу та суспензію нейтрофільних гранулоцитів крові змішують в 2-х пробірках та інкубують одну пробірку при 370С протягом 30 хв., іншу – 120 хв. Після закінчення контакту фагоцитів з тест-культурою вміст пробірок центрифугують, з осаду готують препарати-мазки, фарбують їх за Папенгеймом та мікроскопіюють. Підраховують 200 клітин і визначають відсоток тих, що містять мікробні тіла – фагоцитарний індекс (ФІ). Підраховують фагоцитарне число (ФЧ) – середня кількість поглинутих мікробних тіл одним активним нейтрофілом. Вираховують індекс завершеності фагоцитозу (ІЗФ).
Практичне значення. Вивчення показників фагоцитозу має значення в комплексному аналізі діагностики імунодефіцитних станів: часторецидивуючі гнійні запальні процеси, тривалонезаживаючі рани, схильність до післяопераційних ускладнень. Вони допомагають в діагностиці вторинних імунодефіцитних станів, а також дозволяють спрогнозувати перебіг хвороби.
Показник фагоцитарного індексу в нормі - 40-80%. Фагоцитарне число в нормі складає 3-9. Індекс завершеності фагоцитозу значно більший одиниці свідчить про завершений фагоцитоз, а менший або рівний одиниці – незавершений
Робота 4.Оцінка фагоцитарної активностілейкоцитів периферійної крові людини з використанням мікроорганізмів, мічених флюорохромами.
Принцип методу. Фагоцит, який захопив мікроорганізми, помічені зеленим флюорохромом ФІТЦ, сампочинає інтенсивно флуоресціювати. При цьому він чітко відрізняється від фагоцитів, які не поглинули мікроорганізми. Виходячи із означеного, вираховується фагоцитарний індекс.
Хід роботи. В пластикову пробірку вносять 10 мкл міченого стафілококу або кишкової палички в концентрації 200 млн./мл або 10 мкл мічених дріжджів в концентрації 80 млн./мл, додають 90 мкл цільної гепаринізованої крові, старанно перемішують та інкубують 30 хв. при 370С. Далі вносять 2 мл охолодженого лізуючого розчину на 10 хв. (до повного лізису еритроцитів). Лейкоцити осаджують, відмивають і ресуспендують.
Для вивчення опсонуючої активності сироватки у зразки додають 20 мкл інтактної або прогрітої при 560 С автологічної сироватки. Як контроль опсонізації можна використовувати суміш сироваток від здорових людей.
Після проведення реакції для мікроскопії готують препарати типу висушена крапля, розглядають і підраховують фагоцитарний індекс, використовуючи фазово-контрастну і люмінесцентну мікроскопію.
Практичне значення.Фагоцитарна активність нейтрофілів є однією із найбільш важливих їх функціональних характеристик.
Робота 5. Оцінка завершеності фагоцитозу.
Принцип методу. Мікроорганізми, мічені зеленим флюорохромом ФІТЦ,інтенсивно флуоресціюють, що буде в результаті їх відрізняти від мертвих клітин, які в свою чергу будуть зафарбовані пропідіумом йодидом.
Хід роботи. Мікроорганізми мітять ФІТЦ та зберігають свою життєздатність. Ставлять реакцію поглинання мічених мікроорганізмів фагоцитами. Непоглинуті частинки видаляють і навантажені лейкоцити інкубують для здійснення реакції внутрішньоклітинного кілінгу. Після цього фагоцити руйнують. Мікроорганізми, які залишилися, дофарбовують пропідіуму іодидом, який проникає тільки у мертві клітини. Таким чином, зелена флюоресценція ФІТЦ відрізняє мікроорганізми від клітинного детриту (уламків та ядер лейкоцитів), а пропідіуму іодит служить для визначення відсотку вбитих мікроорганізмів.
Практичне значення. Даний тест дозволяє виявити спадкові дефекти кілінгу мікроорганізмів (хронічну гранулематозну хворобу у дітей, дефіцит мієлопероксидази) і дріжджів (відсутність експресії манозного рецептору, вроджені Т-клітинні імунодефіцити), вторинні імунодефіцити, які супроводжуються важкими (сепсис) та рецидивуючими гнійними інфекціями (фурункульоз, піодермія), стани після хіміо- та променевої терапії.
Робота 6. Визначення титру лізоциму в крові.
Принцип методу. В основі лежить здатність лізоциму лізувати тест-мікроби, внаслідок чого в пробірках буде відсутнє помутніння.
Хід роботи. Приготувати двократні розведення сироватки крові. Для цього в 7 пробірок налити по 0,5 мл фізіологічного розчину, у першу внести 0,5 мл сироватки, перемішати і перенести 0,5 мл у другу пробірку, одержавши розведення 1 : 2, 1 : 4, 1 : 8, 1 : 16, 1 : 32, 1 : 64. Із шостої пробірки 0,5 мл розчину вилити. Сьома пробірка - контрольна, до неї сироватку не вносять. У всі пробірки внести по 0,5 мл суспензії тестової культури Місrococcus lysodeiticus і поставити в термостат на 1 год. Облік реакції: відмітити у яких пробірках відсутній ріст тестової культури і встановити титр лізоциму.
Практичне значення.Визначення активності лізоциму є одним із показників неспецифічного захисту організму, зокрема, активності місцевого захисту.
Робота 7.Визначення титру комплементу.
Принцип методу. Рівень комплементу у сироватці крові визначають за допомогою реакції гемолізу. У цій реакції еритроцити барана є антигенами, а антитіла містяться в гемолітичній сироватці, яку одержують при імунізації кролів еритроцитами барана. При взаємодії антитіл з антигенами еритроцитів активується комплемент і наступає лізис еритроцитів (гемоліз).
Хід роботи. Внести в пробірки гемолітичну сироватку й еритроцити, додати різну кількість (від 0,1 до 0,9 мл) досліджуваної сироватки. Культивувати в термостаті 30 хвилин при 370С. Визначити титр комплементу – найбільше розведення сироватки, яка забезпечує повний гемоліз еритроцитів.
Практичне значення. Показники активності комплементу сироватки крові використовують при оцінці імунного статусу організму, як центральної ефекторної ланки імунного захисту та неспецифічних захисних реакцій.
Робота 8. Вивчення органів імунної системи та їх функції.
Хід роботи.Вивчити за допомогою демонстраційних схем та навчальних таблиць органи імунної системи та їх функції.
Практичне значення.Лімфоїдні органи і тканини, які об’єднані морфологічно і функціонально, складають імунну систему. В них відбувається утворення клітин-попередників усіх популяцій лімфоцитів, макрофагів, еритроцитів, гранулоцитів, моноцитів; дозрівання лімфоцитів, їх лімфопоетична диференціація, набуття ними імунної компетенції; розмноження та нагромадження Т- і В-лімфоцитів, тощо.
Робота 9. Вивчення клітин імунної системи та їх функцій.
Хід роботи.Вивчити за допомогою демонстраційних схем та навчальних таблиць клітини імунної системи та їх функції. Розглянути по мікроскопом препарати-мазки крові. Виявити лімфоцити (макрофаги, моноцити). Звернути увагу на їх будову та відмінність від інших клітин.
Практичне значення.Розуміння функції окремих популяцій клітин імунної системи необхідне для правильної діагностики, патогенетичного, етіотропного лікування та профілактики інфекційних хвороб.
Складання протоколів.Намалювати: схему видів імунітету (робота 1), схему та мікроскопічну картину препаратів (робота 2). Описати методику визначення фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів. Розрахувати опсоно-фагоцитарний індекс (робота 3). Описати принцип постановки дослідів (роботи 4, 5, 6, 7). Описати: органи і клітини імунної системи та їх функції (роботи 8, 9).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.215 - 235.
2. Воробьев А.А. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М., 2008.-С.183 - 186, 194-200.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.139 - 147.
4. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 156 - 157.
5. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.18-45, 78-91, 101-102, 230-235.
6. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 148 - 187.
7. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С.26 - 28.
8. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.194 - 209.
9. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.5-10.
10. Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.40-70, 138-149, 165-205, 300-327.
Самостійна робота 3.
Тема:Цитокіни (монокіни, лімфокіни, інтерлейкіни) та їх значення в імунному процесі.
Актуальність.Знання про цитокіни дає змогу зрозуміти і пояснити цілісність міжклітинних взаємодій у багатоклітинних організмах.
Контрольні питання.
1. Класифікація цитокінів.
2. Особливості цитокінової регуляції.
3. Інтерлейкіни та їх функції.
4. Методи визначення інтерлейкінів в сироватці крові.
5. Інтерферони.
6. Фактори некрозу пухлин.
7. Ростові фактори.
8. Фактор переносу.
9. Хемокіни.
Контроль виконання самостійної роботи.
1. Виберіть речовину – медіатор імунних процесів:
А. С-реактивний білок
В. Фібронектин
С. Інтерферон
D. Інтерлейкін
Е. Перфорин
2. Яку функцію виконують цитокіни?
А. Кілерна
В. Регуляторна
С. Представляюча
D. Транспортна
Е. Рецепторна
3. Назвіть цитокіни з противірусними властивостями:
А. Інтерлейкіни
В. Інтерферони
С. Пропердин
D. Фактор некрозу пухлин
Е. Хемокіни
4. Які цитокіни, секретовані активованим Т-хелпером, призводять до розмноження В-лімфоцитів і утворення клону плазматичних клітин (більше, ніж одна відповідь)?
А. ІЛ-1
В. ІЛ-2
С. ІЛ-4
D. ІЛ-5
Е. γ-ІФН
5. Який інтерлейкін секретує активований фагоцит для стимуляції Т-хелпера?
А. ІЛ-1
В. ІЛ-2
С. ІЛ-3
D. ІЛ-4
Е. ІЛ-5
Приклади тестів «Крок1».
1. При моделюванні запалення нижньої кінцівки у тварини підвищилася температура тіла, збільшився вміст антитіл та лейкоцитів у крові. Які речовини зумовили розвиток цих загальних реакцій організму при запаленні?
А. Мінералокортикоїди
В. *Інтерлейкіни
С. Соматомедини
D. Лейкотрієни
Е. Глюкокортикоїди
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.226 - 234.
2. Воробьев А.А.- Медицинская микробиология, вирусология и иммунология.-М.,2008.-С.233 - 234.
3. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. С.145-147.
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 201, 211- 212, 328.
5. Клінічна імунологія та алергологія (під ред. Проф. Дранніка Г.М.).- Київ., “Здоров’я”.- 2006.- С.92-100.
6. Лаповець Л.Є. та співавт. Посібник з лабораторної імунології.- Львів, 2008.-С.26 - 28.
7. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.199 - 202, 205, 225, 269, 297.
8. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. С.48-49.
9. Якобисяк М.Імунологія.-Вінниця., Нова книга.- 2004.- С.206-219, 258-283.
Заняття 11.
Тема:Специфічний імунний захист організму. Механізми клітинного та гуморального імунітету. Основи трансплантаційної імунології.
Актуальність.Набутий (специфічний) імунітет – потужна ланка опірності організму інфекційним агентам. Знання імунних механізмів і вміння їх досліджувати необхідне при діагностиці інфекційних захворювань, для оцінки імунного статусу організму, трансплантації органів, вибору препаратів для імунопрофілактики та імунотерапії.