Опыт 1. Определение дыхательного коэффициента прорастающих семян

Лабораторная работа № 12.

Определение параметров дыхания

Цель работы: познакомиться с основами экспериментального изучения интенсивности дыхания у растений.

Дыхательный коэффициент (ДК) – это показатель газообмена живых тканей. Он означает отношение количества выделенного при дыхании углекислого газа к количеству поглощенного при этом кислорода:

ДК = СО₂/О₂.

Величина дыхательного коэффициента зависит от ряда причин. Первый фактор – химическая природа окисляемого при дыхании субстрата. Если используются углеводы, то ДК близок к единице:

C₆H₁₂O₆ + 6O₂ = 6 CO₂ + 6 H₂O.

Если окисляются более восстановленные вещества, жиры и белки, то кислорода потребляется больше, чем выделяется углекислого газа, и ДК меньше единицы. Например, при окислении стеариновой кислоты реакция идет по формуле:

C₁₈ H₃₆ O₂+26 O₂=18 CO₂+18 CO₂+18 H₂0;

и отношение CO₂:O₂ равно 18:26, то есть 0,69.

При окислении веществ, содержащих в себе больше кислорода, чем в углеводах, дыхательный коэффициент больше единицы. Так, при дыхании за счет щавелевой кислоты по уравнению

2C₂O₂H₂ + O₂ = 4 CO₂ + 2H₂O

дыхательный коэффициент равен четырем.

Вторым фактором, определяющим величину ДК, являются условия аэрации. При недостатке кислорода в воздухе, то есть в анаэробных условиях, ДК повышается и в случае окисления углеводов становится выше единицы.

Наконец, величина дыхательного коэффициента свидетельствует о полноте окисления субстрата. Если при окислении углеводов процесс распада идет не до конца, а накапливаются промежуточные, более окисленные, чем углеводы, продукты, то величина ДК становится меньше единицы. Подобное явление наблюдается у интенсивно растущих объектов. В работе предлагается один из наиболее простых методов определения ДК прорастающих семян – метод Рихтера.

Ход работы: в опыте используют прибор, состоящий из пробирки, которая плотно закрыта каучуковой пробкой, со вставленной в неё горизонтальной трубкой с делениями. Пробирку поместить в колбу, которая является одновременно и штативом, и термоизолятором.

Прорастающими семенами пшеницы или подсолнечника заполнить 1/2–2/3 объема пробирки и плотно закрыть ее пробкой с измерительной трубкой. Обязательное условие правильного наблюдения – постоянство температуры прибора, так как его работа связана с изменением объемов газов.

Поэтому смонтированный прибор должен принять комнатную температуру, что достигается в течение 5–7 минут.

В конец измерительной трубки ввести каплю жидкости (например, подкрашенную метиленовой синью воду). Для этого, не вынимая пробирку из колбы, погрузить конец трубки в стаканчик с жидкостью. Если жидкость плохо поступает в отверстие, можно слегка постучать кончиком трубки о дно стакана или, вынув трубку из стакана, протереть кончик её фильтровальной бумагой. Если эти меры не помогают, то надо капилляр трубки промыть спиртом и водой. Капля должна подняться по трубке на расстояние 1 см. Таким образом, в приборе создается замкнутое пространство. Всякое изменение в нем объема газов приведет каплю в движение. По скорости этого движения можно судить о газообмене.

При равенстве объемов выделяющегося углекислого газа и поглощающегося кислорода общий объем газов в пробирке останется неизменным, и капля не будет менять своего положения. В том случае, когда поглощается больше О₂, чем выделяется СО₂, в пробирке возникает разряжение газов и капля передвигается внутри по трубке. При условии более интенсивного выделения СО₂ по сравнению с поглощением кислорода капля будет выбрасываться из трубки. Требуется пронаблюдать за поведением капли и, если она перемещается, рассчитать скорость ее движения, определяемую разностью объемов О₂ и СО₂. С этой целью, как только в кончик трубки будет введена капля, необходимо засечь время и ждать, через сколько минут капля пройдет какой-то отрезок пути S. Зная путь S и время t, затраченное на преодоление этого пути, можно рассчитать скорость движения капли:

V = S/ t .

Эту скорость обозначить буквой А. Определить ее 2–3 раза, для дальнейших расчетов взять среднюю величину.

Затем пробирку раскрыть и ввести в нее фильтровальную бумажку, смоченную концентрированным раствором щелочи, которая будет поглощать выделяющийся при дыхании углекислый газ. Пробирку снова закрыть пробкой, дать прибору принять комнатную температуру и 2–3 раза определить скорость движения капли после введения щелочи, обозначить её В. Она зависит от объема поглощенного при дыхании семян кислорода: В = О₂.

Таблица 1

Схема записи опыта

Объект	Скорость движения капли	Дыхательный коэффициент
	до введения щелочи (А)	после введения щелочи (В)
			ср.	ср.

Задание: Значения А и В записать в таблицу 1 и рассчитать величину дыхательного коэффициента объекта, используемого в опыте. Расчет делать по формуле: ДК = В / (В А). Эта дробь дает величину отношения СО₂ к О₂, т. к. В = О₂; А = О₂ – СО₂.

В конце работы объяснить, от чего зависит полученная величина ДК.

Опыт 2. Упрощенный метод определения интенсивности дыхания (по Бойсен-Иенсену)

Настоящий метод основан на учете количества углекислого газа, выделяемого растением в замкнутом пространстве и поглощаемого баритом.

Удобным объектом для работы служат семена. Нужно сравнить интенсивность дыхания прорастающих и покоящихся семян пшеницы.

Следует иметь в виду, что у этого метода есть недостаток: объект находится в замкнутой атмосфере, где может возникнуть дефицит кислорода, и в парах барита, ядовитого для организмов.

Материал и объекты исследования: конические колбы емкостью на 100–200 мл, пробки резиновые, марля для мешочков, нитки, бюретки для титрования, штативы, весы, 0,1 N раствор Ва(ОН)₂, 0,1 N раствор щавелевой кислоты, фенолфталеин, проросшие и покоящиеся семена пшеницы, гороха, ячменя, подсолнечника и др.

Ход работы: в три конические колбы с пробками емкостью на 100–200 мл с помощью бюретки налить по 10 мл 0,1N Ва(ОН)₂. Барит ядовит для человека, и пипеткой брать его небезопасно!Колбы закрыть пробками, чтобы избежать попадания в барит углекислоты из воздуха.

На технических весах взять навески по 3 г сухих и прорастающих семян и поместить их в марлевые мешочки. Мешочки подвесить в колбы над баритом с помощью крючков, вставленных в резиновые пробки.

Необходимо следить, чтобы марля не касалась раствора барита. Третью колбу (без семян) использовать в качестве контроля.

Экспозиция опыта не должна превышать одного часа, так как семена могут оказаться в анаэробных условиях. В ходе опыта колбы надо аккуратно покачивать, чтобы разрушить пленку углекислого бария, образующегося на поверхности раствора при поглощении СО₂. Время опыта должно быть точно учтено.

В конце опыта барит в колбах оттитровать 0,1 N раствором щавелевой кислоты. Титрование лучше начать с контрольной колбы. Сначала установить мениск раствора щавелевой кислоты в бюретке, только после этого открыть пробку и вынуть мешочек с семенами. В раствор барита внести 2–3 капли фенолфталеина, который в щелочи приобретает розовую окраску. Титрование проводить по возможности быстро, чтобы барит не успел поглотить много СО₂ из воздуха. Конец титрования определяется по обесцвечиванию фенолфталеина от одной капли щавелевой кислоты. Раствор становится молочно-белым, и при дальнейшем прибавлении щавелевой кислоты окраска его не меняется. Поэтому важно не пропустить конец титрования. Для проверки точности титрования в обесцвеченный раствор можно капнуть бариту: при хорошей работе от одной капли Ва(ОН)₂ раствор снова порозовеет.

Расчет интенсивности дыхания сделать по формуле

J = [2,2 60(a – b)] / (nt), мг СО₂/г/ч,

где а – количество щавелевой кислоты, пошедшей на титрование при контроле, мл; b – количество щавелевой кислоты, пошедшей на титрование в опытном варианте, мл; 2,2 – мг СО₂, соответствует 1 мл 0,1 N щавелевой кислоты; n – вес сухих семян, г; t – время опыта, мин.

Результаты титрования и расчетов записать в таблицу 2.

Таблица 2

Схема записи опыта

Объект	Навеска семян, г	Продолжи-тельность опыта, мин	Пошло на титрование 0,1N щавелевой кислоты, мл	Интенсивность дыхания семян, мг СО₂/г/ч
контроль	опыт
Сухие семена
Прорастаю-щие семена

Задание: в конце работы сделать вывод о зависимости интенсивности дыхания от влажности семян.