Об утверждении надлежащих фармацевтических практик 5 страница
| Изучение иммунотоксичности и аллергенности 1. Обязательному тестированию подлежат: а) субстанции и все лекарственные формы; б) новые лекарственные формы, содержащие вспомогательные вещества, не разрешенные для применения и медицинской практике и не изученные ранее на этот вид активности, при этом каждое из этих веществ исследуют отдельно; в) фиксированные комбинации нескольких фармакологических веществ в одной лекарственной форме – с изучением самой комбинации и каждого ингредиента в отдельности; г) лекарственные средства с новым составом лекарственной формы, изменением технологии ее изготовления или состава вспомогательных веществ – с изучением только непосредственно готовой лекарственной формы. 2. Тестирование на иммунотоксичность и аллергенность не обязательно для лекарственных средств со следующими показателями: а) для лечения злокачественных новообразований у взрослых; б) для лечения заболеваний, представляющих непосредственную угрозу для жизни; в) новых иммуномодулирующих средств, влияние которых на иммунную систему подробно изучено; г) диагностикумы in vitro. 3. Предварительное изучение. Проводится с целью определения наиболее чувствительной мишени для ксенобиотика и определения его минимально действующей дозы. Наиболее оптимальным является испытание 2-х уровней доз. Минимальная доза – близкая к рекомендуемой для клинических испытаний терапевтическая доза (1TD), максимальная – на порядок выше рекомендуемой для клинических испытаний (10TD), но не выходящая за интервал терапевтической широты действия лекарственного средства. В случае, если реальная терапевтическая доза вещества неизвестна, то для сенсибилизации животных можно использовать дозы, последовательно на порядок меньше чем DL50 (1/10; 1/100; 1/1000 от DL50) при соответствующем способе введения. Животные. Изучение проводится на линейных животных обоего пола. При выборе животных следует учитывать особенности генного контроля. Поскольку у высоко- и низкоотвечающих линий под влиянием ксенобиотиков наблюдается различная модуляция иммуногенеза, в эксперимент следует включать обе оппозитивные группы животных. Желательно проводить исследования на животных 6-8 недельного возраста. В иммунологическом эксперименте обычно используются линейные животные: Мыши: С57Б1/И-2В/ - низкореагирующие на эритроциты барана (ЭБ); СВА/Н-2К/; BALB/c/H-2d/ – высокореагирующие на ЭБ; СВА; DBA/2J/H-2d/; BALB/c – высокая цитотоксическая активность естественных киллеров (ЕК); А/S и /H-2d/; AKP/J/Н-2K – слабая цитотоксическая активность ЕК; /СВАxC57BL/F| - используют в реакции трансплантат против хозяина; BALB/c; C57BL; С3Н/Не/Н-2к – содержат высокий уровень комплемента; Рандомбредные крысы ОИ – продуцирующие IgE; Морские свинки Hardy. Число животных. Группы состоят не менее чем из 10 животных, с учетом получения статистически достоверных экспериментальных данных. Путь введения, рекомендованный для клинического применения. Уровень доз. Желательно использовать не менее 2-х уровней доз. Режим введения. Продолжительность введения вещества подбирается индивидуально, исходить следует из рекомендаций по длительности применения препарата в клинике и сроков, необходимых для получения оптимального иммунного ответа или аллергической реакции в эксперименте. Экспериментальные исследования: перед введением тест-препаратов у животных снимаются фоновые показатели, которые подлежат изучению в опыте (фагоцитоз, хемотаксис, содержание IgA, IgG, IgM); если тестируемое вещество обладает выраженной реакционной способностью, в экспериментах на животных определяют его влияние на вес и клеточность центральных и периферических органов иммунитета и формулу крови. 4. Основное изучение иммунотоксического и аллергенного действия. Животные. Используются не менее двух видов животных обоего пола. Число животных. Экспериментальные группы состоят не менее чем из 10 животных обоего пола. Если иммунотоксическое и аллергенное действие изучается в динамике, необходимо увеличивать количество животных в группе для забоя их в определенные сроки исследования. Каждая группа рандомизируется по весовым показателям. Путь введения. Путь введения соответствует пути клинического назначения препарата. В случае, если рекомендуемый путь, введения в клинике нельзя повторить в эксперименте, тогда экспериментатор оставляет за собой право использовать путь введения лекарственного средства, который вызывает наиболее сильный иммунный ответ или аллергенное действие с учетом того, что чувствительность иммунной системы человека к ксенобиотикам на несколько порядков выше, чем у животных. В связи с этим часто вводят тест- препарат вместе с полным или неполным адъювантом Фрейнда. Уровень доз. Подопытные животные получают не менее 2-х уровней доз для каждого пола, контрольные животные получают в том же объеме и кратности используемый растворитель. Контроль. В исследования включается группа позитивного контроля на иммуноактивность при обязательном интактном контроле. Продолжительность введения. Определяется в зависимости от изучаемых иммунологических и аллергологических показателей с учетом получения оптимального иммунного ответа. Период наблюдения. Изучение функционального состояния иммунной системы продолжается в течение 1 месяца после окончания эксперимента для выяснения обратимости нарушений, вызванных тестируемым препаратом. Методы оценки аллергенного действия тестируемого препарата: оценка анафилактогенной активности в реакции общей анафилаксии (анафилактический шок); активная кожная анафилаксия; реакция гиперчувствительности «замедленного» типа на мышах; реакция иммунных комплексов; метод накожных аппликаций. Методы in situ: методы оценки чувствительности гладких мышц трахеобронхиальной цепочки к исследуемым препаратам в эксперименте на морских спинках. Тесты in vitro: реакция непрямой дегрануляции тучных клеток; реакция торможения миграции макрофагов; псевдоаллергические реакции (тест Шор). Оценку иммунотоксичности лекарственного средства рекомендуется проводить в два этапа. Первый этап оценки позволяет получить минимум интегральных характеристик, охватывающих практически все функции иммунной системы и включает: а) суммарную оценку состояния гуморального иммунитета (реакция гемагглютинации; б) определение содержания антителообразующих клеток; иммунизация эритроцитами барана); г) суммарную оценку состояния Т-клеточного иммунитета – пролиферации в аллосмешанной культуре лимфоцитов (СКЛ) и генерирование Т- киллеров в смещанной культуре лимфоцитов; д) суммарную оценку состояния клеточной естественной резистентности (фагоцитоз, хемотаксис). Тесты 2-го этапа позволяют оценить содержание и функцию субпопуляций клеток иммунной системы. На этом этапе оценивают функциональную активность: а) регуляторных лимфоцитов (определение активности Т-хелперов по продукции интерлейкина-2; б) определение активности Т-супрессоров по торможению реакции бласттрансформации лимфоцитов и смешанной культуры лимфоцитов); в) эффекторных лимфоцитов (определение активности Т-лимфоцитов - реакция бласттрансформации лимфоцитов с Т-митогенами, определение количества Т-лимфоцитов - цитотоксический тест, определение Т-киллеров и естественных киллеров - узнавание, летальный удар; г) определение эффекторов гиперчувствительности «замедленного» типа; определение; активности В-лимфоцитов – пролиферация В-лимфоцитов В-митогенами, определение количества В- лимфоцитов (цитотоксический тест), продукция антител IgA; JgM; IgG по Манчини); д) макрофагов (определение подвижности макрофагов - тест ингибиции миграции макрофагов, определение продукции иптерлейкина-1). Второй этап испытаний препаратов на иммунотоксическое действие проводят в случае если на первом этапе оценки выявлено иммунотоксическое действие лекарственного средства, но его нельзя заменить неиммунотоксическим аналогом, в таких случаях рекомендуется иммунологический контроль на стадии клинических испытаний и целенаправленная коррекция обнаруженного иммунотоксического эффекта с помощью введения иммуномодуляторов. Если количество эффективных лекарственных средств, применяемых при данной патологии очень ограничено. 5. Тестирование на иммунотоксическое и аллергизирующее действие проводят обычно на 7-14-21 сутки после последнего введения лекарственного средства. Если изучают развитие иммунных и аллергических реакций в динамике или определяют возможность обратимости этих нежелательных эффектов, то эксперименты продолжаются до 2-3-х месяцев. Изучение эмбриотоксического действия и влияния на репродуктивную функцию 1. Исследованию на эмбриотоксические свойства подвергаются все новые фармакологические средства, которые назначаются женщинам в репродуктивном периоде жизни, а также вспомогательные вещества, включенные в лекарственную форму новых или уже применяемых лекарственных средств. Исследования включают как изучение состояния потомства к концу антенатального периода развития (I этап исследования), так и состояние потомства в постнатальном периоде жизни (II этап исследования). Испытания ограничиваются I этапом, если препарат является очень сильным или сильным тератогеном. 2. Изучение эмбриотоксического действия на крысах. I этап исследования. Животные. Линейные, гибридные или рандомбредные крысы. Число животных. В подопытной и контрольной группах составляет не менее 20 беременных животных. Первым днем беременности считается день нахождения сперматозоидов в вагинальном мазке. Путь введения. Рекомендованный для клинического применения, при пероральном введении вещество вводят зондом. Дозы. Целесообразно испытание трех доз. В качестве высшей используется максимальная доза, при которой не отмечается гибели самок и развития видимых признаков интоксикации при избранном режиме введения препарата. При испытании высшей дозы малотоксичных веществ объем жидкости, вводимый подопытным животным, не превышает максимально-допустимое количество для данного вида животных и конкретного пути введения. Контрольная группа. В эксперимент включаются группы негативного, позитивного и интактного контроля. Негативному контролю вводят растворитель или добавки используемые для введения субстанции испытуемого вещества. Режим введения. Вещество вводят один раз в сутки различным группам с 1 по 6, с 6 по 16 и с 16 по 19 дни беременности. Изучаемое вещество вводят с 6 по 16 дни беременности и трех дозах, в остальные сроки - в высшей дозе. Если при введении вещества в высшей дозе отмечен эмбриотоксический эффект, то проводят дополнительные исследования для установления пороговой дозы. Сроки введения изучаемого вещества охватывают весь период беременности самок, поскольку чувствительность зародыша к препарату зависит от стадии его развития. Методика оценки: ежедневное наблюдение за состоянием и поведением беременных самок; еженедельное взвешивание животных; эвтаназия и вскрытие самок на 20-й день беременности для оценки результатов; в качестве показателей эмбриотоксического действия определяется пред- и постимплантационная эмбриональная смертность, морфологические (анатомические) пороки развития, общая задержка развития плодов. Предимплантационную смертность определяют по разности между количеством желтых тел в яичниках и количеством мест имплантации в матке; постимплантационную смертность - по разности между количеством мест имплантации и числом живых плодов. Для оценки тератогенного действия подсчитывается число плодов с аномалиями при внешнем осмотре, а затем общее число плодов делится на две группы. У плодов исследуют состояние внутренних органов, у другой (%) - состояние скелета. Все плоды взвешиваются и определяется их краниокаудальный размер. За единицу наблюдения принимают результаты, полученные при вскрытии одной самки. Статистическая обработка результатов проводится методами непараметрических критериев. II этап исследования. Животные. Исследования проводятся на виргильных самках, гибридах или рандомбредных животных. Число животных. В подопытных и контрольных группах получает потомство не менее, чем от 15 самок. Путь введения: Преимущественно адекватный клиническому использованию. Дозы. Испытывается эффективная доза или в несколько раз увеличенная терапевтическая доза. Контрольная группа служит негативным контролем, подвергается воздействию растворителей или других добавок, используемых при введении субстанции. Режим введения: Один раз в сутки, с первого до последнего дня беременности. Методика оценки: ежедневное наблюдение за общим состоянием и поведением беременных самок; ежедневное взвешивание, анализ прироста массы тела; изучение поведения потомства в постнатальном периоде жизни; изучение у потомства нарушений со стороны репродуктивной функции, состояния основных функциональных систем (печени, нервной, эндокринной, иммунной и др.). За 3-4 дня до родов беременные самки размещаются в индивидуальных клетках. В каждом помете оставляют по 8 новорожденных с одинаковым количеством самцов и самок, по возможности. На 23-25 день после рождения крысят отсаживают от матери. Исследования потомства наминают не ранее, чем через 24 часа после рождения и продолжают до 2-3-месячного возраста. Оценка поведения проводится по следующим показателям: общее наблюдение за физическим развитием потомства; скорость созревания сенсорно-двигательных рефлексов в период вскармливания самкой; двигательное и эмоциональное поведение и способность к координации движений у потомства после окончания вскармливания; выработка условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением, сохранение полученных навыков (обучаемость и память). Экспериментальная программа оценки состояния основных систем потомства зависит от фармакологической активности изучаемого препарата и аналогична методам, используемым и токсикологии. При технических трудностях длительного введения препарата, можно вводить его 3-5 дней подряд, но при этом необходимо предусмотреть увеличение числа групп животных, чтобы охватить весь период беременности. При статистической обработке за среднее значение соответствующего показателя принимается величина для отдельного помета, желательно предусмотреть возможность раздельного анализа результатов для самок и самцов. 4. Изучение эмбриотоксического действия на кроликах. Животные. Исследования проводятся на виргильных самках. Число животных. Каждая группа состоит не менее, чем из 12 беременных крольчих. Первым днем беременности считается день нахождения сперматозоидов в вагинальном мазке. Путь введения: Способ введения соответствует клиническому применению лекарственного средства. Дозы. Исследования проводятся на уровне высшей дозы. Контрольная группа. В эксперимент включаются группы негативного, позитивного и интактного контроля. Режим введения: Испытуемое вещество рекомендуется вводить с 6 по 18 день беременности один раз в сутки. Методика оценки: 1) эвтаназию и вскрытие самок проводят на 27-28 день беременности; 2) показателями эмбриотоксичности является пред- и постимплантационная эмбриональная смертность, морфологические пороки развития, общая задержка развития плодов. Подразделения, ведущие тестирование тератогенности, содержит данные «обобщенного» контроля об уровне спонтанного возникновения аномалии развития, полученные на интактных контрольных животных. 4. Изучение влияния лекарственных средств на репродуктивную функцию. Учитывая возможность лекарственных средств вызывать не только уродства и гибель эмбрионов, плодов, но и влиять на гаметогенез, необходимо изучение гонадотоксического действия новых потенциальных лекарственных средств. Виды и линии животных для этих целей отбираются с учетом информации об их репродуктивном статусе, уровня врожденных уродств и чувствительности к известным гонадотоксическим агентам. Желательно проводить исследования на животных с низким уровнем спонтанных уродств. Животные. Исследования проводят на животных обоего пола. Число животных. Рекомендуется иметь в каждой группе не менее 20 самцов и 40 самок. Путь, введения соответствует клиническому способу применения. Уровень доз. Вещество испытывают в 3-х дозах. Контрольная группа. Используются группы негативного, позитивного и интактного контроля. Период введения. Самцам препарат вводят на протяжении 60-70 дней, самкам – 15-30 дней до спаривания. Методика оценки: ежедневное наблюдение, еженедельное взвешивание и определение количества потребляемой пищи. Самок подсаживают к самцам в стадии проэструса и соотношении 2:1 сроком на 2 эстральных цикла. Оплодотворение регистрируют с помощью вагинальных мазков. Половину ссаженных самок умерщвляют на 17-21 день беременности, вторую половину самок оставляют до родов и наблюдают за физическим развитием потомства до окончания периода вскармливания. Критерии оценки: учет уровня пред- и постимплантационной смертности; величин индекса плодовитости и беременности. Изучение мутагенности Изучению мутагенной активности подвергаются все новые фармакологические средства. Для противоопухолевых средств тестирование на мутагенную активность не является обязательным, но при расширении показаний к их применению оценка мутагенности необходима. 1. Учет генных мутаций на индикаторных бактериях (тест Эймса). Штаммы. Используются штаммы Salmonella typhimurium ТА1537, TA98, ТА100. Уровень доз. Необходимо испытание 5 доз препарата. Максимальная доза соответствует 1 мг на чашку. В случае наличия у субстанции антибактериальных свойств, максимальная доза соответствует дозе, вызывающей антибактериальный эффект. Контрольные группы. Необходимо включение в эксперимент групп негативного и позитивного контроля. Группа, получающая растворитель, служит негативным контролем, известные мутагены – позитивным контролем в группах с наличием и отсутствием микросомальной активирующей смеси (S9). Фракция S9 приготовляется из печени млекопитающих, с предварительной индукцией метаболических ферментов. Метаболическая активация. Тест выполняется отдельно с наличием и отсутствием микросомальной активирующей смеси. Представление результатов: исходные данные средние значения показателей ревертантов представляется в таблицах. 2. Тест хромосомных аберраций в клетках костного мозга грызунов. Животные. Используется один из видов грызунов. Животные, используемые для исследования мутагенности, могут быть генетически однородны. Допускается использование мышей-тетрагибридов или рандомбредных животных. Количество животных. Каждая группа содержит не менее 5-ти животных. Путь введения соответствует клиническому способу применения. Доза. Испытывается 1 доза при 1-ой контрольной группе. Используется доза/от DL50 или равная 100-кратной терапевтической дозе для человека. Контрольные группы. Тестирование мутагенности включает негативный и позитивный контроли. Негативный контроль (растворитель) используется для анализа ответных реакций на действие всех возможных переменных, кроме тестируемого соединения. В качестве позитивного контроля используются известные мутагены. Для позитивного контроля предпочтительнее использовать мутаген, сходный по характеру биотрансформации с тестируемым соединением. Если это невозможно, следует использовать модельные мутагены. Режим введения. Используется, однократное введение, в случае необходимости число введений увеличивается. Методика. Все животные экспериментальной группы умертвляется в соответствующее время после введения испытуемого соединения с последующим приготовлением гистопрепаратов на стадии метафазы. Используются 2 срока экспозиции испытуемого соединения у животных - 6 и 24 часа. Анализу подвергаются 100 метафазных клеток у каждого животного. Представление результатов: общее число проанализированных клеток; процентное соотношение из них аберрантных; спектр аберраций и процентное соотношение их; значение х2 статистики соотношения нормальных и аберрантных метафазных клеток в подопытных и контрольных группах. 3. Тест доминантных летальных мутаций у грызунов. Животные. Один вид грызунов. Количество животных. Каждая группа содержит не менее 15 самцов, к каждому самцу подсаживается по 3 самки еженедельно в течение 3 недель. Путь введения соответствует рекомендованному для человека. Дозы. Испытывается одна доза и одна контрольная группа. Используется доза/от DL50 или равная 100-кратной терапевтической дозе для человека. Контрольная группа. Когда в вводимом лекарственном средстве имеется растворитель, контрольная группа получает этот растворитель. Режим введения. Используется однократное введение, в случае необходимости, число введений увеличивается. Методика. Обработанные самцы еженедельно в течение 3 недель спариваются с интактными самками; все подопытные самки умертвляются и соответствующее время после спаривания с самцами; после вскрытия самок подсчитывается число живых и мертвых эмбрионов у каждой беременной самки. Представление результатов: процент фертильных самок; суммарное число живых и мертвых эмбрионов в группах; значение х2 статистики соотношения живых и мертвых эмбрионов в подопытных и контрольных группах на каждой стадии сперматогенеза (неделе). 4. Учет генных мутаций на индикаторных бактериях с использованием млекопитающего в качестве промежуточного хозяина. Штаммы. Используются штаммы Salmonella typhimurium ТА1950, ТА1534. Животные: мыши. Испытывается одна доза препарата. Используется доза /от DL50 или равная 100-кратной терапевтической дозе для человека. Препараты с антибактериальным действием целесообразно использовать в дозах: /DL50, 1/10 DL50, 1/100 DL50 и 1/1000 DL50, чтобы уровень гибели индикаторных бактерий не превышал 90%. Путь введения, соответствует способу, рекомендованному для человека. Контрольная группа. Необходимо включение в эксперимент групп негативного и позитивного контроля. Режим введения. 1 мл культуры бактерий вводится внутрибрюшинно, сразу же после введения культуры вводят изучаемое лекарственное средство. Внутрибрюшинное введение изучаемого препарата делают через 30 минут после введения культуры животному. Методика. После 3 часовой инкубации животное умерщвляют разрывом шейного отдела позвоночника, вводят внутрибрюшинно буфер, вскрывают брюшную полость и отбирают из нее бактериальную суспензию. Рассевают суспензию на чашки с селективным агаром для получения числа ревертантов и, после предварительного разведения, на чашки с питательным мясопептонным агаром. Представление результатов: исходные данные, включающие число ревертантов на число выживших бактерий; титр бактериальной суспензии; показатель числа ревертантов на мл по данному варианту; показатель частоты индуцированных мутаций с использованием статистического анализа с помощью критерия Уилкоксона. 5. Учет ДНК-повреждающего действия. Штаммы: E. coli WP2 дикого типа и polA, recA-мутантные. Дозы. Необходимо испытание 6 доз препарата. Для антибактериальных препаратов используют в качестве минимальной концентрации ту, при которой наблюдается рост мутантных штаммов, а максимальной концентрации - ингибирующую рост бактерий. Промежуточными являются концентрации в 2 и 4 раза меньше максимальной. Контрольные группы. Негативный контроль (растворитель) и позитивный контроль – введение соединения, вызывающего ДНК-повреждающий эффект. Методика. Культуру жизнеспособных бактерий добавляют к испытуемому химическому соединению и инкубируют при 37оС и течение 18 час. Для лучшей видимости роста бактерий в суспензию добавляют индикатор бромкреозол пурпуровый, который изменяет свой цвет от голубого к желтому при изменении рН среды за счет роста бактерий. Представление результатов: регистрация наличия или отсутствия роста штамма дикого типа и мутантных бактерии проводится в таблице знаками «+» или «-». | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Изучение канцерогенности 1. Обязательному тестированию на канцерогенность подвергаются все новые лекарственные средства, со следующими показаниями: а) применяемые в качестве профилактических, лечебно-косметических, репеллентных средств и контрацептивов; б) предназначенные для применения в течение всей жизни длительными (более 15 дней) повторными курсами; в) предназначенные для использования без рецепта врача широкими слоями населения; г) предназначенные для применения в детской практике, а также для лечения беременных женщин и в период лактации. 2. Тестированию канцерогенности не подлежат лекарственные средства: а) для лечения злокачественных новообразований у взрослых; б) для лечения заболеваний, представляющих непосредственную угрозу для жизни. 3. Экспериментальные животные. Виды и линии лабораторных животных выбираются с учетом их устойчивости к инфекционным заболеваниям, продолжительностью жизни, спонтанного выхода опухолей, чувствительности к известным канцерогенам. Животные различных видов и линий используются в предварительных испытаниях и в хроническом эксперименте с учетом свойств исследуемого препарата. Методы исследования. Предварительное изучение. Проводится с целью определения уровней доз для хронического эксперимента. Изучение острой токсичности ведется на небольшом числе животных с целью определения доз для субхронического эксперимента. Изучение субхронической токсичности дает возможность выбрать максимально-переносимую дозу (МПД) для проведения хронического эксперимента. Животные. Используются мыши, крысы, хомячки. Изучение проводится на 2-х видах животных обоего пола, здоровых, 6-8 недельного возраста. Число животных: Группы включают по 10 животных обоего пола. Путь введения. Вещество вводится тем же способом, что и в хроническом эксперименте. Пероральное введение препарата проводится зондом. Возможно смешение исследуемого препарата с пищей или водой. Содержание изучаемого лекарственного средства в пище не превышает 5%. Введение изучаемого лекарственного средства с пищей или питьевой водой рассчитывается индивидуально на каждое животное после предварительного изучения стабильности препарата в указанных условиях. Уровень доз. Используется не менее трех доз. Высокая доза вызывает некоторые признаки токсического действия, минимальная не обладает подобным эффектом. Режим сведения. Вещество вводится в течение 90 дней, ежедневно. В случае проявления кумулятивного эффекта, продолжительность введения увеличивается. Экспериментальные исследования: ежедневный осмотр всех животных; ежедневное взвешивание всех животных; макро- и микроскопическое изучение всех органов и тканей павших животных и умерщвленных в конце эксперимента. Представление результатов: максимальная доза в хроническом эксперименте соответствует дозе, вызывающей в подостром опыте снижение прироста массы тела животных не более, чем на 10% по сравнению с контролем; максимальная доза определяется для каждого вида животных обоего пола. 4. Изучение канцерогенности в хроническом эксперименте. Животные. Используются не менее двух видов животных обоего пола 6-8 недельного возраста. Число животных. Группы состоят не менее, чем из 50 животных обоего пола. Каждая группа рандомизируется в соответствии с массой тела. Путь введения. Путь введения соответствует клиническому назначению препарата. Пероральное введение препарата проводится зондом. Возможно смешение исследуемого препарата с пищей или водой. Содержание изучаемого лекарственного средства в пище не превышает 5%. Введение изучаемого лекарственного средства с пищей или питьевой водой рассчитывается индивидуально на каждое животное после предварительного изучения стабильности препарата в указанных условиях. Уровень доз. Подопытные группы получают не менее 3-х уровней доз для самцов и самок на фоне соответствующих контрольных групп. Максимальная доза определяется по результатам предварительного эксперимента. Минимальная доза соответствует среднеэффективной дозе для конкретного вида животных, используемого в хроническом эксперименте. Желательно определение средней дозы по принципу геометрической прогрессии. Контрольные группы. Негативный и интактный контроль. Продолжительность введения. Не менее 24 месяцев и не более 30 месяцев для крыс, не менее 18 месяцев и не более 24 месяцев для мышей и хомячков при ежедневном, введении. Период наблюдения. Изучение заканчивается через 2-3 месяца после окончания введения препарата. Если смертность от кумуляции превышает 75% от малой дозы, то все выжившие животные умерщвляются и изучение прекращается. Смертность от интеркуррентных заболеваний составляет в пределах 50% после 24 месяцев введения препарата для крыс и 18 месяцев для мышей и хомячков. Потеря животных в течение эксперимента от каннибализма не превышает 10% от общего числа в группе. Экспериментальные исследования: ежедневный осмотр всех животных в каждой группе; еженедельное взвешивание в первые 3 месяца ведения, в последующие сроки 1 раз в 4 недели; вскрытие, макроскопическое изучение и гистологическое исследование органов и тканей всех павших животных. Обязательно макроскопическое исследование всех органов и тканей. Гистологическому исследованию подвергаются следующие органы и ткани: кожа, молочные железы, лимфатические узлы, слюнные железы, грудина, костный мозг, тимус, трахея, легкие, сердце, щитовидная и паращитовидная железа, язык, пищевод, желудок, 12-перстная кишка, печень, поджелудочная железа, селезенка, почки, надпочечники, мочевой пузырь, семенные пузырьки, простата, яички, яичники, матка, влагалище, глаза, мозг, гипофиз, спинной мозг и другие органы и ткани с выраженными макроскопическими изменениями. Умирающие и больные животные изолируются, умертвляются, подвергаются вскрытию, описывается макроскопически, органы и ткани подвергнуты гистологическому исследованию. Выявленные изменения в виде опухолей включаются в описание повреждений, исследованы макроскопически и гистологически. По возможности, желательно провести анализ крови. При окончании исследования все выжившие в каждой группе умерщвляются, подвергаются вскрытию, макроскопическому обследованию. Гистологическое изучение всех органов проводится для всех животных, получавших большую дозу, и контрольной группы. При обнаружении существенных различий в частоте возникновения опухолей под влиянием большой дозы по сравнению с контролем, гистологическому исследованию подвергаются все органы и ткани животных других подопытных групп. Классы токсичности веществ в соответствии с модифицированной классификацией Организации экономического содействия и развития (OECD)
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Приложение 6
к Стандарту надлежащей лабораторной
практики Республики Казахстан