Вызывающих брожение и неполное окисление субстрата
План
Т. Постановка элективных культур микроорганизмов, вызывающих процессы неполного окисления субстрата:
1. Спиртовое брожение.
2. Молочнокислое брожение.
3. Маслянокислое брожение.
4. Анаэробное разложение пектиновых веществ.
5. Анаэробное разложение клетчатки.
6. Аэробное разложение клетчатки.
7. Аэробное окисление этилового спирта в уксусную кислоту.
8. Правила работы с чистыми культурами.
Материалы и оборудование
1. Спиртовое брожение: дрожжи, 10-процентный раствор сахарозы, концентрированный и 10-процентный раствор щелочи, кристаллический йод, баритовая или известковая вода, водяная баня, горелка, треножник, термометр, колба на 200-250 мл, пробка с газоотводной трубкой, ванночка или кристаллизатор, пробирка, мензурка на 100 мл.
2. Молочнокислое брожение: свежее молоко, рассол кислой капусты, раствор фенолфталеина, 0,1 н. раствор гидроксида натрия (NaOH), дистиллированная вода, вата, коническая колба на 100-150 мл, пипетка на 20 мл, пипетка на 10 мл, коническая колба на 100 мл, термометр, бюретки.
3. Маслянокислое брожение: солод, сахароза, почва (желательно садовая, с перегноем), семена гороха, мел, вода, весы с разновесами, газовая горелка, высокая пробирка и кружка.
4. Анаэробное разложение пектиновых веществ: стебли льна или конопли, кружка, горелка, пробирка, нитки, пробиркодержатель, ножницы, термостат.
5. Анаэробное разложение клетчатки: питательный раствор следующего состава: вода - 100 мл, пептон - 0,1 г, дигидрофосфат калия (КН2Р04) -0,1 г, сульфат магния (MgS04*7H20) - 0,05г, хлорид кальция (СаС12) - 03 г, дигидрофосфат аммония (NH4H2P04) - 0,2 г, карбонат кальция (СаСОз) - 0,5 г, колбы на 50-100 мл, закрытые пробками с газоотводными трубками, термостат, почва, фильтровальная бумага.
6. Аэробное разложение клетчатки: кремневые пластинки в чашках Петри, фильтровальная бумага, питательная среда следующего состава: дистиллированная вода - 200 мл, нитрат калия (KN03) - 2,5 г, дигидрофосфат калия (КН2Р04) - 1 г, хлорид натрия (NaCi) - 0,5 г, сульфат магния (MgS04*7H20) - 0,5г, сульфат железа (II) (FeS04*7H20) - 0,01 г, сульфат марганца (III) (Мп2(804)з) - 0,01 г, унавоженная почва или перегной.
7. Аэробное окисление этилового спирта в уксусную кислоту: 2 конические колбы на 100-150 мл, непастеризованное пиво, 10-процентный раствор уксусной кислоты, вата, нитки, бумага, чайный "гриб".
Ход работы
Спиртовое брожение. За 30 мин. до занятия дрожжи разводят в 10- процентном растворе сахарозы. В коническую колбу объемом 200-250 мл наливают 50 мл 10-процентного раствора сахарозы и 10 мл взвеси дрожжей. Колбу закрывают пробкой с газоотводной трубкой. Для собирания газа нижний изогнутый конец трубки опускают в кристаллизатор с водой и надевают на него пробирку, наполненную водой. Колбу погружают в водяную баню с температурой 30-3 5°С. На протяжении всего опыта такая температура поддерживается при помощи спиртовой (или газовой) горелки. Через 30-40 мин., когда весь воздух из колбы будет вытеснен углекислым газом, собирают последний в новую пробирку, которая также должна быть заполнена водой.
Молочнокислое брожение. В широкодонную колбу объемом 100-150 мл наливают 40 мл свежего молока, закрывают ватной пробкой и помещают в термостат при температуре 30-35°С до следующего занятия.
Маслянокислое брожение. В кружку насыпают 5 г солода (источник органических соединений), 2 г мела (для нейтрализации масляной кислоты), 5 г сахара и все заливают 100 мл дистиллированной воды. Смесь кипятят в течение 5 мин. Горячую жидкость переливают в высокую пробирку, на дно которой бросают для заражения бактериями комочек почвы или семена гороха. Пробирку помещают в термостат при температуре 30-35°С на 7 дней.
Анаэробное разложения пектиновых веществ. Делают снопик из 5-7 стебельков льна длиной 4-5 см, перевязывают его в двух местах ниткой. Для удаления экстрактивных веществ снопик погружают в кружку с водой и кипятят около 10 мин. Затем снопик переносят в пробирку с водой и снова кипятят, чтобы удалить из воды кислород. Для заражения среды бактериями вносят в пробирку кусочек стебля льна. Пробирку помещают в термостат при температуре 25-30°С на 10-14 дней.
Анаэробное разложение клетчатки. В колбу на 50-100 мл помещают полоски фильтровальной бумаги и доверху заливают питательной средой следующего состава:
Затем заражают среду бактериями, внося комочек почвы (богатой перегноем), закрывают пробкой с газоотводной трубкой и помещают в термостат при температуре 30°С на 5-7 дней. Под влиянием бактерий в анаэробных условиях фильтровальная бумага будет разлагаться.
Результаты опытов учитываются через 2 недели.
Аэробное разложение клетчатки. На кремневые пластинки в чашки Петри помещают фильтровальную бумагу, смоченную 2-3 мл питательного стерильного раствора следующего состава: 
Затем на поверхности фильтрата размещают в шахматном порядке 10-15 маленьких комочков почвы. Чашки Петри помещают в эксикатор над водой, а последний - в термостат при температуре 25-30°С на 15 дней.
Выращивание уксуснокислых бактерий. Уксуснокислые бактерии окисляют этиловый спирт до уксусной кислоты и воды. Процесс аэробный, идет с накоплением значительного количества энергии: 
Известно несколько видов уксуснокислых бактерий, например: Асе- tobacter aceti, A. Pasteurianum, A. xylinum.
Все уксуснокислые бактерии грамотрицательны, имеют форму палочек, часто слагающихся в цепочки, образуют на поверхности растворов характерные пленки, состоящие из полисахаридов.
Уксуснокислые бактерии окисляют спирт (вино, пиво) и другие продукты, содержащие алкоголь.
Правила работы с чистыми культурами. На практических занятиях по микробиологии используют обычно чистые культуры микроорганизмов, выращенные в пробирках. Основное условие работы с этими культурами - сохранение их стерильности. Для этого необходимо знать основные правила работы с чистыми культурами. Пересев культуры из пробирки на подготовленную среду производится микробиологической иглой с петелькой на конце (так называемой петлей). Петля предварительно стерилизуется в пламени газовой или спиртовой горелки. Работающий берет петлю в правую руку, а пробирку с культурой в левую и держит ее в несколько наклонном положении; при помощи большого пальца и мизинца (или одного мизинца правой руки, прижимая его к ладони) вынимает из пробирки ватную пробку, обжигая края пробирки в пламени горелки, и с помощью петли правой рукой берет с поверхности питательной среды немного микробной массы. Затем, снова обжигая края пробирки и пробку, плотно закрывает ею пробирку и ставит ее в штатив.
Микроорганизмы, взятые при помощи петли, переносят на предметное стекло в каплю воды. Если микроорганизмы из пробирки нужно взять еще раз, всю процедуру повторяют снова. После получения мазка петлю обязательно вторично стерилизуют. Все предметные и покровные стекла и пипетки после работы тоже тщательно дезинфицируют. Стекла и пипетки помещают в раствор фенола или спирта.
Контрольные вопросы
1. Что вы понимаете под дыханием микроорганизмов?
2. Какие типы дыхания микроорганизмов вы знаете?
3. Сущность и возбудители спиртового брожения.
4. Сущность и возбудители молочнокислого брожения.
5. Сущность и возбудители маслянокислого брожения.
6. Сущность и возбудители уксуснокислого "брожения".
7. Использование различных типов брожения в промышленности и сельском хозяйстве.
Занятие7. Знакомство с микроорганизмами, вызывающими брожение
План
1. Качественное определение молочной кислоты, образующейся в результате молочнокислого брожения.
2. Микроскопическое исследование микроорганизмов молочнокислого брожения: а) гомоферментативного; б) гетероферментативного.
3. Анализ продуктов, полученных в результате маслянокислого брожения.
4. Микроскопическое исследование маслянокислого брожения.
5. Микроскопическое исследование бактерий: а) разложения пектиновых веществ; б) анаэробного и аэробного разложения клетчатки; в) уксуснокислых.
Материалы и оборудование
1. Культуральная жидкость с бактериями маслянокислого и молочнокислого брожения: рассол капусты или огурцов, скисшее молоко, культуры бактерий пектинового брожения, анаэробного и аэробного разложения клетчатки, чайный "гриб", культура уксуснокислых бактерий.
2. Красители: раствор йода, фенолфталеин, метиленовый синий.
3. Реактивы: гидроксид бария, 96-процентный спирт, серная кислота (H2S04) конц., 0,1 н раствор гидроксида натрия (NaOH), 5-процентный раствор перманганата калия (КМп04), гидроксид аммония (NH4OH), 1- процентый раствор нитрата серебра (AgN03), 1-процентный раствор хлорида железа (III), сода, смесь спирта с эфиром 1:1, 5-процентный раствор фенола.
4. Иммерсионное масло.
5. Дистиллированная вода.
6. Предметные и покровные стекла.
7. Предметные стекла с углублением.
8. Микроскопы.
9. Препаровальные иглы.
10. Стеклянные палочки.
11. Микробиологические петли.
12. Длинная стеклянная трубка.
13. Спиртовка или газовая горелка.
14. Пробирки.
15. Штативы для предметных стекол.
16. Фильтровальная бумага.
17. Бюретки.
18. Капельная и мерные пипетки на 10-20 мл.
19. Конические колбы на 50 мл.
20. Лотки.
Основные сведения
Обмен веществ у микроорганизмов складывается из двух основных процессов: энергетического (получение энергии за счет окисления субстрата) и конструктивного (биосинтез веществ в клетке). Эти два процесса неразрывно между собой связаны и происходят за счет сопряженных биохимических ферментативных реакций.
Окисление субстрата у различных микроорганизмов происходит разными путями. У аэробных микроорганизмов этот процесс протекает при участии кислорода воздуха - его называют дыханием. В результате такого окисления осуществляется полное расщепление углеводов до углекислого газа и воды, при этом выделяется значительное количество энергии, запасаемой в основном в виде молекул АТФ. У анаэробных микроорганизмов субстрат окисляется без доступа кислорода. С помощью ферментов водород отщепляется от субстрата и переносится на определенные органические акцепторы. В результате образуется ряд органических веществ, таких, как спирты и органические кислоты (молочная, масляная, пропионо- вая), и аккумулируется небольшое количество энергии. Такой тип окисления субстрата называется брожением. В зависимости от конечных продуктов, получаемых в результате брожения, его называют спиртовым, молочнокислым, маслянокислым и т.д.
Для ряда микроорганизмов характерен процесс неполного окисления субстрата с использованием небольшого количества кислорода. В этом случае окисление субстрата идет не до конца и в качестве конечных продуктов образуются кислоты: уксусная, фумаровая, щавелевая, лимонная - и ряд других соединений. Часто такой тип окисления называют окислительным брожением, что не совсем верно, так как брожение идет анаэробно, а при неполном окислении субстрата микроорганизмы используют кислород воздуха. Неполное окисление присуще следующим микрооргниз- мам: уксуснокислым бактериям, миксобактериям, разлагающим клетчатку и др., некоторым грибам, актиномицетам.
Спиртовое брожение. Спиртовое брожение вызывается дрожжевыми грибками. В процессе его молекула сахара сбраживается с образованием этилового спирта и углекислого газа: 
Спиртовое брожение идет в анаэробных условиях, тогда как размножение дрожжей лучше происходит при широком доступе кислорода. Оптимальные температурные условия для спиртового брожения - 30-35°С. Образующийся спирт вреден для дрожжей, и при накоплении его процесс брожения прекращается. Однако при высокой концентрации сахара в растворе дрожжи могут оставаться живыми в среде, содержащей до 15% спирта.
Молочнокислое брожение. Молочнокислое брожение вызывается молочнокислыми бактериями. В северных широтах возбудителем этого брожения являются в основном Streptococcus lactis, Lactobacillus lactis, а в южных районах - Lactobacillus bulgaricus (болгарская палочка).
В результате брожения лактоза (молочный сахар) или какой-либо другой сахар, например, глюкоза, разлагается с образованием молочной кислоты. Процесс идет с накоплением энергии в виде молекул АТФ. Молочнокислое брожение суммарно может быть выражено уравнением: 
Микроорганизмы, вызывающие молочнокислое брожение, по его характеру могут быть разделены на гомоферментативные, образующие из сахара только молочную кислоту (указанные выше виды), и гетерофермен- тативные, образующие, кроме молочной кислоты, другие продукты брожения: спирт, уксусную кислоту, углекислый газ (Lactobacillus plantarum, L. fermenti, Escherichia coli).
Маслянокислое брожение. При маслянокислом брожении происходит распад углеводов до масляной кислоты, углекислого газа и водорода: 
Маслянокислое брожение вызывается облигатными анаэробными бактериями из рода Clostridium.
Разложение пектиновых веществ. Пектины — основа межклеточного вещества. Они входят также в состав оболочек растительных клеток.
Пектиновые вещества могут разлагаться особыми анаэробными бактериями до моносахаридов, которые затем сбраживаются ими до масляной кислоты. К этим бактериям относятся Clostridium pectinovorum, имеющая форму плектридия (барабанной палочки), и С. felsineum. Ниже приводятся уравнения разложения пектиновых веществ: 
Анаэробное разложение клетчатки. Анаэробное сбраживание клетчатки осуществляется почвенными целлюлозными бактериями, которые были выделены русским микробиологом В.Л. Омелянским. Бактерии были названы Вас. cellulosae methanicus, Вас. cell, hydrogenicus, а впоследствии Clostridium omelianskii.
Брожение происходит по типу маслянокислого. Под воздействием ферментов целлюлазы и целлобиазы бактерии последовательно гидролизуют клетчатку до целлобиозы и глюкозы; последняя сбраживается до масляной кислоты с выделением углекислого газа, водорода и метана:
Аэробное разложение клетчатки. Аэробное разложение клетчатки идет в поверхностных слоях почвы. Оно вызывается несколькими видами микроорганизмов: извитыми бактериями (Cellvibrio, Cellfalcicula), миксо- бактериями (Cytophaga, Sporocytophaga, Sorangium), некоторыми видами грибов и актиномицетов. Большинство этих микроорганизмов обладает активными ферментами, гидролизующими клетчатку. Первые этапы разложения клетчатки идут так же, как и у анаэробов, - до моносахаридов. Однако в результате неполного окисления при затрате небольшого количества кислорода моносахариды разлагаются до органических кислот с выделением энергии. Дальнейшее окисление субстрата приводит к образованию углекислого газа и воды.
Уксуснокислые бактерии. Уксуснокислые бактерии окисляют этиловый спирт до уксусной кислоты и воды. Процесс аэробный, хотя его часто называют брожением. Он идет с накоплением значительного количества энергии:
Известно несколько видов уксуснокислых бактерий, например: Acetobacter aceti, A. pasteurianum, A. xylinum.
Все уксуснокислые бактерии грамотрицательны, имеют форму палочек, часто слагающихся в цепочки, образуют на поверхности растворов характерные пленки, состоящие из полисахаридов.
Уксуснокислые бактерии окисляют спирт (вино, пиво) и другие продукты, содержащие алкоголь.
Ход работы
Спиртовое брожение. Для обнаружения углекислого газа приливают в пробирку небольшое количество баритовой или известковой воды, которая от углекислого газа мутнеет, или пробирку с углекислым газом опускают в перевернутом виде в чашку с 10-процентным раствором щелочи; через 20-30 мин. в результате взаимодействия углекислого газа со щелочью уровень жидкости в пробирке поднимается.
Для обнаружения спирта отливают в пробирку 10мл бродящей жидкости, приливают к ней 1-2 мл концентрированного раствора щелочи и подогревают до 60°С. Затем бросают несколько кристалликов металлического йода и продолжают нагревать. В присутствии спирта выпадает желтый осадок йодоформа, который можно определить по запаху.
Суммарное уравнение реакции получения йодоформа: 
Приготовить препарат дрожжей методом раздавленной капли, окрасить метиленовым синим, зарисовать (рис. 11).
Молочнокислое брожение. Для обнаружения молочной кислоты, образовавшейся в результате деятельности молочнокислых бактерий, можно пользоваться такими качественными реакциями:
1. Перевод молочной кислоты в уксусный альдегид. Молочная кислота в кислой среде окисляется перманганатом калия до уксусного альдегида, который с аммиачным раствором оксида серебра дает реакцию серебряного зеркала.
В коническую колбу через складчатый фильтр отфильтровывают 5 мл скисшего молока, добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты, ставят на асбестовую сетку и нагревают до кипения, затем по каплям приливают 5 мл 5-процентного раствора перманганата калия КМп04. После чего покрывают горлышко колбы фильтровальной бумагой, смоченной аммиачным раствором оксида серебра. Через некоторое время бумага чернеет: 
2. Проба с фенолом (реакция Уффельмана).10мл 5-процентного раствора фенола внести в пробирку и прибавить несколько капель слабого раствора хлорида железа (III), в результате получится интенсивно окрашенный синий раствор. От одной-двух капель сыворотки кислого молока, содержащих молочную кислоту, он становится желтоватым.
3. Микроскопическое исследование микроорганизмов гомоферментативного молочнокислого брожения. Наносят на чистое предметное стекло петлей каплю кислого молока, делают мазок, высушивают его на воздухе и фиксируют смесью спирта с эфиром (1 : 1), несколько раз обливая препарат этой смесью. При такой фиксации параллельно идет извлечение эфиром жира (капельки жира мешают рассмотрению микроорганизмов). Фиксированный препарат окрашивают метиленовым синим в течение двух минут. Затем краситель смывают, просушивают препарат и рассматривают с иммерсией (рис. 18).
Под микроскопом можно обнаружить мелкие овальные или палочковидные клетки, нередко соединяющиеся по 2,3 и более, - Streptococcus lactis, Lactobacterium acidophyllum.
4. Микроскопическое исследование бактерий гетероферментативного молочнокислого брожения.
На предметное стекло наносят небольшую каплю рассола кислой капусты или огурцов, готовят мазок, фиксируют его, красят фуксином, промывают, высушивают и рассматривают с иммерсией. Под микроскопом можно обнаружить мелкие равномерно окрашенные бесспоровые палочки Lactobacillus fermenti, L. plantarum, L. brassicum (рис. 19).
5. Микроорганизмы, участвующие в порче кисломолочных продуктов. Берут пленку с поверхности кислого молока или сметаны, стоявших в теплом месте 3-5 дней. Можно взять также плесень с поверхности рассола квашеных овощей. Готовят препарат, растирая кусочек плесени в капле воды, и добавляют краситель (метиленовая синь, нейтральный красный), накрывают покровным стеклом и рассматривают под микроскопом. Хорошо видны крупные четырехугольные или овальные клетки молочной плесени Oidium lactis (рис. 20).
Этот гриб окисляет молочную кислоту до оксида углерода (IV) и воды, ухудшая качество скисшего молока.
Маслянокислое брожение. Для обнаружения углекислого газа С02, выделяющегося при маслянокислом брожении, к испытуемой жидкости приливают раствор гидроксида бария Ва(ОН)2. Выпадает осадок карбоната бария. Наличие масляной кислоты в пробирке легко обнаружить по неприятному запаху прогорклого масла. Для обнаружения масляной кислоты проводят такую реакцию: наливают в пробирку 3-4 мл испытуемой жидкости, прибавляют к ней 0,5 мл 90-процентного спирта и 1-2 капли концентрированной серной кислоты. Содержимое пробирки хорошо взбалтывают и нагревают. В присутствии масляной кислоты появляется характерный запах масляноэтилового эфира, напоминающий запах ананаса:
При микроскопическом исследовании бактерий маслянокислого брожения можно использовать метод висячей капли или метод фиксации с окраской фуксином. Каплю жидкости при приготовлении препарата берут стеклянной трубочкой или пипеткой со дна высокой пробирки (маслянокислое брожение происходит в анаэробных условиях). Один из главных возбудителей маслянокислого
брожения - бацилла Clostridium pasteurianum.
Эта подвижная палочка в период спорообразования приобретает форму веретена вследствие того, что спора образуется в середине клетки (рис. 21). Зарисовывают рассматриваемые бактерии.
Бактерии разложения пектиновых веществ. После брожения (постановку см. в занятии 7) вынимают из пробирки снопики льна. Обнаруживают, что лубяные волокна легко отделяются от других тканей.
Готовят препарат живых бактерий Clostridium pectinovorum. Для этого пинцетом отжимают из снопика на предметное стекло каплю жидкости, окрашивают ее раствором йода, накрывают стеклом и рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Бактерии Clostridium pectinovorum можно рассматривать при фиксации и окраске. Они имеют плектридиальную форму (рис. 22).
Бактерии анаэробного разложения клетчатки. Извлекают из бродильной жидкости фильтровальную бумагу. Пинцетом счищают с нее на предметное стекло каплю жидкости, приготавливают мазок, фиксируют,
окрашивают фуксином и рассматривают с иммерсионной системой. На препарате видны тонкие изогнутые палочки и плектридии целлюлозных бацилл, отдельные споры, а также микроорганизмы-спутники. Анаэробное разложение клетчатки в основном является результатом жизнедеятельности Clostridium omelianskii. Это длинные тонкие палочки, слегка изогнутые; на концах палочек - шаровидные споры, значительно превосходящие толщину клетки, т.е. бактерии имеют плектридиальную форму (рис. 23).
Бактерии аэробного разложения клетчатки. Рассматривают колонии микроорганизмов аэробного разложения клетчатки, выросших на фильтровальной бумаге в чашках Петри.
Вокруг комочков почвы можно видеть зоны, окрашенные в желтый, оранжевый, зеленый цвета, а также бесцветные зоны клетчатки, подвергшейся разрушению. Эти изменения свидетельствуют о развитии микроорганизмов, разлагающих клетчатку.
Из цветных колоний приготовляют мазок, фиксируют, окрашивают фуксином, рассматривают с иммерсионной системой, зарисовывают. На препарате, приготовленном из желтой слизистой влажной колонии, обнаруживается бактерия рода Cytophaga, относящаяся к группе целлюлозоразлагающих миксобактерий.
Кроме Cytophaga, в чашках Петри можно обнаружить колонии других миксобактерий - Sporocytophaga, Sorangium. Клетки этих бактерий вытянуты, иногда заострены на концах. Они способны образовывать микроцисты, из которых формируются плодовые тела. При созревании из цист выходят молодые вегетативные клетки. Миксобактерии обладают способностью к скользящим движениям по субстрату. Они интенсивно разлагают клетчатку.
К аэробам, разлагающим клетчатку, относятся также представители рода Cellvibrio. Клетки этой бактерии мелкие, слегка изогнутые. При развитии на субстрате некоторые виды этого рода образуют зеленый и желтый пигменты, которые окрашивают бумагу в соответствующие цвета.
Кроме этих бактерий, в разложении клетчатки принимают активное участие Cellfalcicula viridis, клетки которой имеют палочковидную форму с заостренными концами или веретенообразную. При развитии этой бактерии на фильтрованной бумаге возникают зеленые пятна.
Аэробно разлагают клетчатку также некоторые грибы (из родов Fusarium, Aspergillus и др.) и актиномицеты.
Уксуснокислые бактерии - бесспоровые грамотрицательные малоподвижные палочки. Они растут и размножаются на поверхности питательных сред, образуя тонкие пленки, так как являются облигатными аэробами. Acetobacter xylinum образует более толстые и плотные пленки, так как клеточные оболочки этих бактерий содержат в своем составе целлюлозу. При неблагоприятных условиях клетки уксуснокислых бактерий разрастаются, принимая необычную (инволюционную) форму утолщенных длинных нитей.
Для обнаружения в питательной среде уксусной кислоты 5 мл скисшего пива наливают в пробирку, добавляют небольшое количество соды и раствор хлорида железа (III). В присутствии уксусной кислоты при нагревании появляется темнокрасное окрашивание ацетата железа:
Рассматривают образовавшуюся в колбе пленку, в которой обычно можно найти: a) Acetobacter aceti - короткую неподвижную палочку, образующую гладкую слизистую пленку, желтеющую от раствора йода (рис. 24); б) Acetobacter pasteurianum, которая образует сухую морщинистую пленку, поднимающуюся по стенкам колбы и окрашивающуюся раствором йода в синий цвет; в) Acetobacter xylinum, образующую толстую, слизи-
Рассматривают образовавшуюся в колбе пленку, в которой обычно можно найти: a) Acetobacter aceti - короткую неподвижную палочку, образующую гладкую слизистую пленку, желтеющую от раствора йода (рис. 24); б) Acetobacter pasteurianum, которая образует сухую морщинистую пленку, поднимающуюся по стенкам колбы и окрашивающуюся раствором йода в синий цвет; в) Acetobacter xylinum, образующую толстую, слизистую пленку. Приготавливают мазок, окрашивают его раствором йода и рассматривают под микроскопом.
Для знакомства с уксуснокислыми бактериями можно приготовить препарат из пленки чайного «гриба», состоящей из уксуснокислых бактерий и одного из видов дрожжей (Candida), живущих в симбиозе с бактериями.
Как известно, чайный «гриб» растет на растворе сахара. Дрожжи сбраживают сахар до этилового спирта, а уксуснокислые бактерии окисляют спирт до уксусной кислоты.
Делают мазок из пленки чайного «гриба», препарат фиксируют, окрашивают раствором йода и рассматривают под микроскопом. На препарате видны палочки, собранные в цепочки Acetobacter xylinum, и округлые клетки дрожжей.
Можно рассматривать препарат методом раздавленной капли.
Отчет о выполненной работе должен содержать рисунки всех изученных микробов и записи уравнений реакций.
Контрольные вопросы
1. Какие микроорганизмы вызывают спиртовое брожение?
2. Какими способами можно обнаружить спирт и углекислый газ при спиртовом брожении?
3. Какие микроорганизмы вызывают молочнокислое и маслянокислое брожение?
4. Каким способом можно обнаружить молочную кислоту?
5. Как можно обнаружить масляную кислоту в культуральной среде?
6. Какие микроорганизмы вызывают процессы анаэробного разложения клетчатки?
7. Как протекает процесс разложения пектиновых веществ? Напишите уравнения реакции.
8. В чем практическое значение процессов разложения пектиновых веществ?
9. В чем особенности жизнедеятельности чайного «гриба»?
Тема 5. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОЦЕССЫ ПРЕВРАЩЕНИЯ АЗОТИСТЫХ ВЕЩЕСТВ
Занятие 8. Выращивание микроорганизмов, участвующих в круговороте азота
План
1. Аммонификация.
2. Азотфиксация.
3. Нитрификация.
4. Денитрификация.
Материалы и оборудование
1. Культуры азотфиксирующих, аммонифицирующих, нитрифицирующих и денитрифицирующих бактерий.
2. Корни бобовых растений с клубеньками (фиксированные в спирте или свежевыращенные в почве).
3. Реактивы: Несслера и Грисса, соли для элективных сред.
4. Раствор дифениламина в серной кислоте.
5. Красители: фуксин, метиленовый синий.
6. Иммерсионное масло.
7. Микроскопы.
8. Предметные и покровные стекла.
9. Предметное стекло с вышлифованным углублением.
10. Лезвия безопасных бритв.
11. Стеклянные палочки.
12. Пипетки: на 10 мл - 1 шт., на 1 мл - 4 шт., капельные пипетки.
13. Пробирки - 6 шт.
14. Кристаллизатор.
15. Фарфоровая чашечка.
16. Штативы для предметных стекол.
17. Лотки.
Основные сведения
Микроорганизмам принадлежит очень большая роль в круговороте азота на Земле. Все высшие и большинство низших растений синтезируют белок из связанного азота и углеводов. Животные используют в питании белки, накопленные растениями. Отмирая, животные и растения обогащают почву белковыми веществами, которые под влиянием гнилостных бактерий разлагаются до аммиака. Аммиак частично используется бактериями для их жизнедеятельности, основная же его масса либо непосредственно усваивается высшими растениями, либо подвергается в почве нитрификации. В результате процесса нитрификации, осуществляемого микроорганизмами в почве, образуются нитраты, которые могут активно поглощаться многими растениями. При определенных условиях эти азотсодержащие вещества могут частично подвергаться процессу денитрификации, т.е. восстановлению до молекулярного азота; денитрификацию вызывают особые группы бактерий. Бактерии-азотфиксаторы усваивают атмосферный азот и переводят его в восстановленные формы. Так при участии бактерий происходит круговорот азота в природе.
В ходе занятия студенты должны подготовить питательные среды и произвести посев микроорганизмов, вызывающих процессы аммонификации, нитрификации, денитрификации и связывания атмосферного азота.
Микроорганизмы в питательные среды в большинстве случаев вносят с почвой. Выросшие бактерии рассматривают на двух следующих занятиях.
Гниение (аммонификация) - один из наиболее распространенных процессов на земной поверхности. Сущность его заключается в распаде органических азотсодержащих веществ до аммиака, т.е. превращении органической формы азота в аммиачную. Поэтому процесс гниения получил название аммонификации. Он происходит везде, где есть органические остатки. Особенно распространен этот процесс в почве.
Аммонификация вызывается различными группами микроорганизмов (бактериями, актиномицетами, плесневыми грибками); все они получили название аммонификаторов. Процесс гниения происходит как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Наилучшими условиями для аммонификации является температура 25...30°С и достаточная влажность.
Процесс нитрификации заключается в окислении бактериями аммиака до азотной кислоты. Этот процесс идет в две фазы: в первой фазе аммиак под влиянием бактерий рода Nitrozomonas и др. окисляется до азотистой кислоты. Вторая фаза вызывается бактериями, относящимися к роду Nitrobacter, окисляющими азотистую кислоту до азотной.
Энергию, выделяемую при окислении неорганических соединений (аммиака и азотистой кислоты), микроорганизмы используют для синтеза органических веществ, для роста и размножения. Нитрификаторы относятся к группе хемосинтезирующих бактерий, за счет химической энергии они синтезируют органические вещества из неорганических. Бактерии- нитрификаторы не могут использовать готовые органические вещества.
Денитрификация - процесс, по своему действию обратный нитрификации. В почве он вызывается различными микроорганизмами, такими, как Pseudomonas fluorescens, P. stutzeri, P. aeruginosa, Micrococcus denitri- ficans, и другими.
Все денитрифицирующие бактерии бесспоровые, относятся к факультативным анаэробам. При доступе большого количества кислорода они не восстанавливают нитраты. Лучше всего денитрификация идет при наличии влаги, нитратов и органического вещества.
Главными фиксаторами молекулярного азота являются бактерии. Одни из них, например, клубеньковые бактерии, живут в симбиозе с растениями, другие — в свободном состоянии в почве (Azotobacter chroococcum, Clostridium pasteurianum). A. chroococcum - облигатный аэроб, свободно живущий в почве и интенсивно фиксирующий свободный азот. В молодом возрасте это подвижная крупная короткая палочка с закругленными концами и перитрихальным расположением жгутиков. Клетки образуют слизистую капсулу. По мере старения подвижность клеток утрачивается, они приобретают шаровидную форму и располагаются попарно; слизистая капсула в это время уплотняется. Образуется темно- коричневый пигмент, придающий колониям характерный цвет.
Для выращивания Azotobacter chroococcum необходима нейтральная питательная среда, содержащая минеральные соли и органические вещества (углеводы, спирты, кислоты).
В настоящее время изучены другие виды рода Azotobacter: A. agilis, A. vinelandii, - которые различаются между собой размерами, формой клеток, пигментацией колоний, а также бактерии родов Derxia и Bejerinkia.
Клубеньковые бактерии относятся к роду Rhizobium. В почве это свободноживущие мелкие подвижные палочки. Фиксацию молекулярного азота они способны осуществлять в симбиозе с корнями бобовых растений определенных видов. Проникновение бактерий в паренхиму корня происходит через молодые корневые волоски. Клубеньковые бактерии выделяют вещества, стимулирующие деление клеток паренхимы корня, в результате чего и образуются клубеньки. В них клетки бактерий становятся более крупными, неподвижными, приобретают неправильную форму; это их инволюционные формы, или бактероиды.
Клубеньковые бактерии снабжают растения соединениями азота. Бобовые растения обеспечивают бактерии безазотистыми веществами и создают для них оптимальные условия существования.
Бактерии, вызывающие аммонификацию. Среди аммонификаторов наиболее распространенную группу составляют аэробные гнилостные бактерии: Вас. mesentericus, Вас. subtilis, Вас. megaterium. Сюда же относится Вас. mycoides - бактерия, имеющая форму палочки; на твердой питательной среде она образует колонии, по внешнему виду напоминающие мицелий гриба (рис. 5, 17).
Вас. subtilis, или сенная палочка, характеризуется тем, что ее клетки в результате деления не расходятся, а образуют цепочки. На третий день после посева она формирует споры (рис. 3).
Bact. marcescens (Serratia marcescens), или «чудесная палочка», синтезирующая красный пигмент, тоже относится к гнилостным бактериям.
Вторая группа - факультативные анаэробы. Наиболее широко распространенный вид, относящийся к этой группе, - Proteus vulgaris. Этот микроорганизм в зависимости от условий и состава питательной среды может иметь весьма разнообразные форму и величину: от короткой палочки до длинной, вытянутой, иногда изогнутой под прямым углом.
К третьей относятся анаэробы, представителем которых является Вас. putrificus — спорообразующий микроб, имеющий вид барабанной палочки.
Микробы, вызывающие нитрификацию. Бактерии, окисляющие аммиак до азотистой кислоты (нитрозные), относятся к роду Nitrozomonas. Эти бактерии имеют овальную форму клеток, почти неподвижны (рис. 25). В результате их жизнедеятельности (в первой фазе нитрификации) из аммиачных солей в питательном растворе образуется азотистая кислота. Наличие этой кислоты устанавливают реактивом Грисса.
Под действием микроорганизмов рода Nitrozomonas азотистая кислота окисляется до азотной. Nitrobacter имеет вид мелких неподвижных палочек (рис. 25). Наряду с ним, могут быть формы, дающие скопления бактериальных клеток (зооглеи). Клетки Nitrobacter характеризуются полиморфностью.
Ход работы
Выращивание культур микроорганизмов, участвующих в превращениях азотистых веществ. Выращивание бактерий-аммони- фикаторов:
1. В две колбочки на 100 мл наливают по 50 мл воды и вносят по 1 г пептона и по комочку почвы, которая всегда содержит гнилостные бактерии. Закрывают колбочки ватными пробками, в пробках укрепляют в одной красную лакмусовую бумажку (индикатор на аммиак), а в другой - бумажку, пропитанную раствором ацетата свинца (индикатор на сероводород). Ставят колбы в термостат при температуре 25...30°С на 7...8 дней.
2. Производят посев Serratia marcescens («чудесной палочки») на естественную стерильную питательную среду. Для этого из пробирки с чистой культурой бактерии стерильной петлей делают посев в чашки Петри на ломтики картофеля. До стерилизации ломтики картофеля протирают кусочком мела для нейтрализации органических кислот в субстрате.
3. Приготовление элективной питательной среды для выращивания Вас. subtilis (сенной палочки). 5-10 г сена помещают в коническую колбу объемом 500-1000 мл, приливают 200 мл воды и кипятят в течение 20-30 мин. Жидкость сливают в коническую колбу с широким дном и кипятят раствор, добавив в него кусочек мела. Для заражения бактериями в колбу вносят несколько стебельков сухого сена, затем ее закрывают ватной пробкой и ставят в термостат с температурой 25-30°С на 2-3 дня.
Выращивание бактерий, вызывающих нитрификацию. Для выращивания и накопления культуры бактерий рода Nitro- zomonas, вызывающих первую фазу нитрификации, пользуются элективной питательной средой Омелянского и Виноградского, которая не содержит органических веществ. Состав среды следующий:
Взвесив все соли, их высыпают в коническую колбу на 1000 мл, наливают 100 мл дистиллированной воды, тщательно размешивают, вносят комочек почвы, закрывают колбу ватной пробкой, прикрепляют этикетку и ставят в термостат с температурой 25-30°С на 15, а лучше на 20 дней.
Для выращивания бактерий, вызывающих вторую фазу нитрификации (род Nitrobacter), готовят среду следующего состава:
Приливают 100 мл дистиллированной воды, размешивают, вносят комочек почвы, закрывают колбу ватной пробкой, прикрепляют этикетку и ставят в термостат на 15 дней.
Нитрифицирующие бактерии можно выращивать также на твердой питательной среде (твердая элективная питательная среда по Виноградскому). Приготовление кремневых пластинок для этой среды описано выше.
Кремневые пластинки для микробов первой фазы нитрификации в чашках Петри пропитывают 2 мл питательной среды следующего состава:
Чтобы получить элективную твердую питательную среду для микробов второй фазы нитрификации, вместо сульфата аммония (NH^SC^ берут 2 г нитрита натрия NaN02.
После того, как избыток воды впитается гелем и частично испарится, на пластинке в шахматном порядке раскладывают мелкие комочки почвы, закрывают чашку Петри и ставят ее в эксикатор над водой, а последний - в термостат с температурой 25-30°С на 15-20 дней.
Выращивание бактерий, вызывающих денитрификацию. Готовят питательную среду, в которую входят:
Кальциевую соль органической кислоты можно заменить 2-процентным раствором глицерина.
Питательную среду кипятят и после остывания выливают в высокую пробирку, на дно которой бросают комочек почвы. Закрывают пробирку ватной пробкой, ставят в термостат с температурой 25-30 С на 15 дней.
Выращивание азотобактера. Стерильная питательная среда для азотобактера имеет следующий состав:
Стерилизуют чашку Петри, разогревают приготовленную и находящуюся в пробирке стерильную питательную среду, выливают ее в чашку Петри и закрывают крышкой. После того, как масса застынет, на ее поверхность наносят несколько комочков почвы. Чашку подписывают и ставят в термостат при температуре 25°С на 6-7 дней.
Контрольные вопросы
1. Как поставить элективную культуру бактерий-аммонификаторов?
2. В каких условиях идет процесс нитрификации?
3. В чем сущность процессов микробиологической и «косвенной» денитрификации?
4. Как поставить элективную культуру азотобактера?
Занятие 9.Изучениебактерий, участвующих в превращениях соединений азота
План
Микроскопическое исследование бактерий:
а) аммонификации;
б) азотфиксации;
в) нитрификации;
г) денитрификации.
Материалы и оборудование
1. Элективные культуры бактерий, участвующих в превращении соединений азота.
2. Корни бобовых растений с клубеньками (фиксированные в спирте или свежевыращенные в почве).
3. Реактивы: Несслера и Грисса.
4. Раствор дифениламина в серной кислоте.
5. Красители: фуксин, метиленовый синий.
6. Иммерсионное масло.
7. Микроскопы.
8. Предметные и покровные стекла.
9. Предметное стекло с вышлифованным углублением.
10. Лезвия безопасных бритв.
11. Стеклянные палочки.
12. Пипетки: на 10 мл - 1 шт., на 1 мл - 4 шт., капельные пипетки.
13. Пробирки - 6 шт.
14. Кристаллизатор.
15. Фарфоровая чашечка.
16. Штативы для предметных стекол.
17. Лотки.
Ход работы
Аммонификация.В колбах, где происходил процесс аммонификации, при помощи бумажных индикаторов определяют наличие сероводорода и аммиака. Аммиак можно также обнаружить при помощи реактива Несслера. В зависимости от концентрации аммиака жидкость окрашивается в желтый, оранжево-желтый и красно-бурый цвета. В пробирку приливают приблизительно по 2-3 мл испытуемой жидкости и столько же реактива Несслера. При проведении всех цветных реакций необходимо внимательно следить за тем, чтобы мерные пипетки были абсолютно чистыми, а для реактивов использовались отдельные капельные пипетки.
Для микроскопического исследования аммонифицирующих бактерий наносят каплю культуральной жидкости на предметное стекло, приготавливают мазок, фиксируют и окрашивают фуксином. На препарате, как правило, обнаруживается бактерия Proteus vulgaris, имеющая форму либо короткой, либо длинной палочки (рис. 7). Кроме того, можно видеть и другие аммонифицирующие бактерии, видовую принадлежность которых бывает трудно установить, так как выращивание производилось не в чистой культуре.
Сенную палочку (Вас. subtitis) рассматривают на фиксированном и окрашенном фуксином препарате, приготовленном из поверхностной пленки бактерий, выращенных в элективной питательной среде (рис. 3).
Для рассмотрения Serratia marcescens мазок готовят из красной колонии, выросшей на ломтике картофеля в чашке Петри. Видны мелкие палочки, спор они не образуют.
Азотфиксация. Микроскопическое исследование Azotobacter chroococcum. В чашках Петри на твердой среде вокруг комочков почвы образуются темно-коричневые слизистые колонии Azotobacter chroococcum. Приготавливают фиксированный и окрашенный фуксином препарат, клетки бактерий имеют шаровидную форму и соединены попарно; вокруг клеток видны капсулы. Обнаружить капсулу можно при негативной окраске препарата тушью или нигрозином в раздавленной капле (рис. 14).
Микроскопическое исследование клубеньковых бактерий и клубеньков бобовых растений. Из клубеньков на предметное стекло выдавливают содержимое. Приготавливают мазок, фиксируют и окрашивают метиленовым синим. На препарате видны бактероиды и палочковидные клубеньковые бактерии.
Клубеньковые бактерии можно рассмотреть и в живом состоянии в раздавленной или висячей капле.
Анатомическое исследование клубеньков. Для исследования делают ряд тонких срезов через клубенек корня фасоли, гороха, конских бобов. Срезы рассматривают в капле воды при большом увеличении. Срез можно слегка подкрасить метиленовым синим. Клубенек представляет собой сильно разросшийся участок клеток паренхимы корня. Паренхимная ткань, содержащая значительное количество бактерий, называется бактероидной.
* Нитрификация. Проводят анализ на азотистую кислоту в колбах, где происходила первая фаза нитрификации. Для этого в чистую пробирку наливают примерно 1 мл реактива Грисса, кипятят, прибавляют1 мл испытуемой жидкости и снова кипятят. В присутствии азотистой кислоты появляется красное окрашивание.
Выясняют, образовалась ли в культуральной жидкости с Nitrobacter (вторая фаза нитрификации) азотная кислота. Наличие ее в среде можно установить по реакции с дифениламином, растворенным в крепкой серной кислоте. Посинение жидкости говорит о наличии в ней азотной кислоты.
Однако надо помнить, что дифениламин дает реакцию не только с азотной, но и с азотистой кислотой. Поэтому о появлении в растворе азотной кислоты можно судить лишь после того, как реактивом Грисса будет установлено, что в жидкости нет азотистой кислоты.
Реакцию на азотную кислоту проводят в фарфоровой чашке, смешивая в ней несколько капель испытуемой жидкости с раствором дифениламина.
Из культуральных жидкостей первой и второй фаз нитрификации готовят мазки, фиксируют и окрашивают их фуксином. Рассматривают под микроскопом и зарисовывают (рис. 25).
Денитрификация. В результате денитрификации происходит восстановление оксидов азота до молекулярного азота. О том, что происходит денитрификация, можно судить по выделению пузырьков газа со дна пробирки, а также по исчезновению в питательном растворе азотной и азотистой кислот (см. реакцию на азотную и азотистую кислоты).
Бактерии, вызывающие денитрификацию, бесспоровые, очень мелкие, имеют форму коротких палочек, иногда почти овальные. К денитри- фикаторам относятся следующие бактерии: Pseudomonas fluorescens, P. stutzeri, Micrococcus denitrificans.
Все денитрификаторы - факультативные анаэробы, поэтому для приготовления препарата каплю жидкости надо брать со дна пробирки, где процесс идет наиболее энергично.
Препарат фиксируют, окрашивают фуксином и рассматривают под микроскопом с иммерсией, делают зарисовки.
Контрольные вопросы
1. В чем сущность процесса аммонификации и в каких условиях он может идти?
2. Перечислите виды бактерий-аммонификаторов.
3. При участии каких микроорганизмов протекает процесс нитрификации?
4. Какие соли, содержащие азот, следует добавлять в питательные среды для выращивания бактерий Nitrozomonas и Nitrobacter?
5. С помощью каких качественных реакций можно обнаружить в культуральной жидкости наличие нитритов, нитратов и аммиака?
6. Какие условия необходимы для выращивания денитрифицирующих бактерий?
7. Какие газообразные вещества выделяются в процессе денитрификации?
8. Какие микроорганизмы могут усваивать молекулярный азот?
Тема 6. ФИТОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ
Занятие 10.Знакомство с некоторыми микроорганизмами- возбудителями болезней растений
План
Микроскопическое исследование:
1. фитопатогенных бактерий, вызывающих мокрую гниль клубней картофеля - Bact. xanthochlorum schuster;
2. фитопатогенных грибов: картофельного грибка - Phytophtora infestans, снежной плесени озимых посевов - Fusarium nivale, черной хлебной плесени — Rhizopus nigricans, плесени, поражающей овощи и фрукты, грибков из рода Sclerotinia.
Материалы и оборудование
1. Культуры исследуемых бактерий и грибов.
2. Фуксин.
3. Микроскоп.
4. Предметные и покровные стекла.
5. Иммерсионное масло.
6. Иглы и петли для пересева.
7. Препаровальные иглы.
8. Стеклянные палочки.
9. Газовая горелка или спиртовка.
10. Штативы для предметных стекол.
11. Лотки.
Основные сведения
Существует очень много микроорганизмов, вызывающих различные заболевания растений. Значительная часть болезней растений имеет бактериальное или вирусное происхождение; основная же масса болезней вызывается различными патогенными грибами.
Бактерия, вызывающая мокрую гниль Bact. xanthochlorum schuster, легко проникает через поврежденные покровные ткани в клубень картофеля. Бактерии разлагают межклеточное вещество, протоплазму клеток, разрушают ткани, что в конце концов приводит к гибели клубня. Бактерии хорошо размножаются на картофеле во влажных, плохо проветриваемых овощехранилищах. Меры предохранения от заражения состоят в том, чтобы хранить картофель в сухом прохладном помещении.
Плесневые грибы. Тело гриба - мицелий - состоит из тонких нитей, или гиф, переплетенных между собой. У низших грибов мицелий несег- ментированный - не имеет поперечных перегородок, а у высших грибов гифы имеют перегородки и расчленены на клетки. При бесполом размножении у грибов образуются спорангии, содержащие споры (споры эндогенного происхождения) или же конидии (споры экзогенного происхождения).
Конидии отрываются и разносятся ветром, а спорангиоспоры образуются внутри спорангия и освобождаются при разрушении его стенки.
При классификации фитопатогенных грибов и определении их вида большое внимание уделяется строению мицелия и органов размножения.
Грибы - бесхлорофилльные микроорганизмы, живут на поверхности различных субстратов. Клетки грибов имеют дифференцированное ядро, поэтому их относят к эвкариотам. Плесневые грибы не требовательны к питательным средам, но большинство из них нуждается в кислороде воздуха. Они легко переносят низкие температуры, могут жить и размножаться в холодильных камерах. Среди грибов встречаются как сапрофиты, так и паразиты. Все грибы делятся на высшие и низшие и относятся к шести классам.
Хитридиевые (Chytridiomycetes), оомицеты (Oomycetes), зигомицеты (Zygomycetes) относят к низшим грибам; аскомицеты (Ascomycetes), бази- диомицеты (Basidiomycetes) и дейтеромицеты, или несовершенные грибы (Deuteromycetes, Fungi imperfecti), - к высшим.
Грибы не имеют хлорофилла, поэтому они используют для своего питания углерод только из готовых органических соединений, то есть они являются гетеротрофами. Все грибы, кроме примитивных низших и некоторых высших (дрожжей), имеют вегетативное тело - мицелий, или грибницу,- состоящее из тонких ветвящихся гиф. Мицелий может быть погруженным (субстратный), развивающимся внутри среды и поверхностным (воздушный), развивающимся на поверхности среды. У низших грибов он одноклеточный. Септы (перегородки) перфорированы, что обеспечивает сообщение между клетками и таким образом создает замкнутую систему, состоящую из гиф (трубочек), заполненных цитоплазмой и множеством ядер. Иногда мицелий грибов образует ризоиды - корешкообразные выросты, при помощи которых крепится к субстрату и получает питательные вещества.
Склероции - сплетение гиф округлой или продолговатой формы. Они имеют большие размеры, уплотнены, устойчивы к неблагоприятным воздействиям среды, содержат мало воды и много питательных веществ. У некоторых высших грибов склероции представляют почкующуюся стадию мицелия.
Многие грибы образуют хламидоспоры - разросты мицелия с утолщенной оболочкой, внутри которых содержатся питательные вещества. Они могут быть одно- и многоклеточными и служат для сохранения вида, так как хорошо переносят неблагоприятные условия среды.
От мицелия отходят плодоносящие тела - спорангиеносцы у муко- ровых и конидиеносцы у монилиевых. Спорангиеносцы заканчиваются расширением - спорангием с эндоспорами. При разрыве спорангия эндоспоры освобождаются и, попадая в благоприятные условия, дают начало новой плесени. На конидиеносцах образуются конидии, или экзоспоры. Они имеют разную форму: шаровидную, булавовидную, продолговатую и т. д. Конидии могут быть одиночные, когда образуются по одной на каждом ответвлении конидиеносца, и множественными, если образуется несколько конидий. Конидиеносцы бывают простые (неразветвленные) и разветвленные. Разветвленные имеют на конце ветвления - верхушечные клетки бутыловидной или веретеновидной формы, называемые фиалидами у пеницилла. У аспергилла такие клетки имеют форму шипов и называются стеригмами. Они располагаются на расширении конидиеносца и бывают одно- и двухъярусные. Нижняя клетка стеригм несет несколько клеток второго яруса.
Рост на сусло-агаре. Мукор (Mucor mucedo) - представитель класса зигомицетов - растет в виде пушистого серого налета. Рост появляется в течение первых суток. Аспергилл (леечная плесень) - представитель класса дейтеромицетов. Растет медленнее. Рост появляется на вторые сутки.
Конидии могут быть черного цвета (Aspergillus niiger), желто-зеленого (Asp. fumigatus), желтого (Asp. flavus) и зеленовато-желтого (Asp. oryzae). Пеницилл (кистевик) - представитель класса дейтеромицетов, образует на среде нежный налет в виде пушка серо-зеленого цвета или ярко-зеленого с белым ободком по периферии. Хорошо выраженные кисточки появляются на вторые-третьи сутки.
Ход работы
Бактерии, вызывающие мокрую гниль картофеля. Препаровальной иглой снимают небольшое количество слизистого налета с клубня картофеля, пораженного мокрой гнилью Bact. xanthochlorum schuster, размешивают его на предметном стекле в капле воды. Мазок фиксируют, окрашивают фуксином и рассматривают с иммерсионным объективом. В поле зрения микроскопа видны бактерии, имеющие форму небольших палочек. Рассматриваемые микробы зарисовывают.
Фитопатогенные грибы. Приготовление препаратов. Плесневые грибы рассматривают в препарате «раздавленная капля», для чего материал препаровальными иглами распределяют на предметном стекле в капле изотонического раствора хлорида натрия или стерильной воде.
Препарат мукора готовят из односуточной культуры, аспергилла и пеницилла - из двухсуточных. В культуре мукора и аспергилла лучше брать серые головки, пеницилла - на границе серого и зеленого по периферии колонии. У аспергилла с серыми, но не с черными конидиями бывают хорошо видны стеригмы в виде лепестков подсолнечника. Мукор рассматривают под малым увеличением (объектив 8), аспергилл - расширение конидиеносца - вначале находят под малым увеличением, затем более детально рассматривают под средним. Пеницилл изучают под средним увеличением (объектив 40). Необходимо помнить, что плесневые грибы размножаются спорами. Поэтому препарат надо готовить вблизи предметного стекла, не допуская рассевания спор.
Препаровальные иглы по окончании работ тщательно стерилизуют над пламенем горелки.
Фузариум (несовершенные грибы).
Мицелий белый, розовый или желтый. От него отходят короткие ветвящиеся конидиеносцы, на концах которых располагаются конидии. Они могут быть серповидными с несколькими перегородками (макроконидии) и овальными (микроконидии), чаще без перегородок.
Хламидоспоры бывают шаровидными,
грушевидными, располагаются скоплениями или цепочкой. Образуются в старых конидиенос- цах, строме, конидиях. Воздушный мицелий хорошо развит (рис. 26).
Фузариумы широко распространены в природе.
Многие из них вызывают порчу плодов, овощей, поражают всходы растений. У пораженных растений листья пожелтевшие, на их поверхности - серовато-розовый налет. Фузариумы, особенно при низких температурах, образуют токсины (зеараленон, Т-2 микотоксин и другие). При поедании животными и птицей пораженных растений и зерна наступает их отравление. Клинически это проявляется в угнетении, нарушении координации движений и других признаках. Микотоксин зеараленон вызывает у свиней эстрогенизм, дегенеративные изменения яичников, матки, что приводит к бесплодию. Т-2 микотоксин поражает желудочно-кишечный тракт, сердечно-сосудистую, нервную системы, а также костный мозг, лимфатические узлы и другие органы и ткани.
Дрожжи. Это безмицелиальные одноклеточные почкующиеся грибы, относятся к классу аскомицетов. Форма клеток разная, но чаще овальная, округлая, лимоноподобная.
Клетки дрожжей имеют оболочку, цитоплазму и, в отличие от прокариот, оформленное ядро, которое хорошо видно в неокрашенном препарате. Цитоплазма молодых клеток более однородна, с возрастом появляются вакуоли. Дрожжи крупнее бактериальных клеток, их диаметр колеблется от 10 до 15 мкм. Внутри клеток дрожжей образуются споры, после чего они становятся сумками (асками). Число спор - от 4 до 12. Различают еще артроспоры, или покоящиеся клетки дрожжей. Они отличаются от вегетативных форм наличием двухконтурной оболочки, большим количеством запасных питательных веществ (гликогена, жира) и отсутствием вакуолей. Размножение дрожжей происходит почкованием, спорами и половым путем (копуляцией). На поверхности материнской клетки после отделения почки остается дочерний шрам, который состоит из хитина и представляет округлое выпячивание с приподнятым ободком по периферии (рис. 11).
Приготовление препаратов. Каплю культуры дрожжей Saccharomyces cerevisiae, которую готовят заранее, наносят петлей на предметное стекло. Накрывают покровным стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Клетки дрожжей видны и при меньшем увеличении (х400), но для сравнения их размеров с другими микроорганизмами препарат лучше рассматривать под иммерсионной системой.
Микроскопическая картина: в поле зрения микроскопа видны округлые и вытянутые клетки, среди которых встречаются и почкующиеся.
Картофельный гриб фитофтора (Phytophtora infestans) поражает листья, стебли и клубни картофеля (рис. 27). Споры его прорастают и образуют мицелий, который проникает внутрь тканей, преимущественно по межклетникам, и вызывает их отмирание, ткани при этом приобретают бурую окраску. Через устьица на поверхность листьев выходят воздушные гифы в виде белого пушка. На концах воздушных нитей формируются конидии, напоминающие по форме плоды лимона с сосковидными бугорками на концах. Конидии отпадают целиком. В сырую погоду при температуре ниже 18°С в конидии образуются подвижные зооспоры, которые передвигаются во влажной среде с помощью двух жгутиков. При температуре выше 18°С конидии прорастают гифой, которая проникает в здоровые ткани листа или других органов картофеля, вызывая заражение этой культуры.
Препаровальной иглой снимают небольшое количество пушистого налета с пораженной фитофторой ткани (лучше клубня картофеля), размешивают его на предметном стекле в капле воды, накрывают покровным стеклом и рассматривают при большом увеличении микроскопа (метод раздавленной капли).
Плесневый гриб ризопус (Rhizopus nigricans) - низший гриб, относится к семейству мукоровых. Мицелий ветвистый, неклеточный: плодоносящие гифы заканчиваются черными шарообразными спорангиями с эндоспорами (рис. 28). Спорангии после созревания лопаются, и споры рассыпаются. Споры прорастают особыми выростами - ризоидами, прикрепляются к субстрату. Проросший гриб быстро распространяется по поверхности субстрата во все стороны с помощью гиф, столонов или ризоморфов. Поражает семена зерновых культур, участвует в разрушении и порче различных плодов, овощей, хлеба и других продуктов.
Препаровальной иглой отбирают небольшое количество мицелия гриба. Готовят препарат методом раздавленной капли, рассматривают под микроскопом и зарисовывают.
Склеротиния (Sclerotinia) поражает овощи и фрукты, образуя на них пушистый белый налет. Спора прорастает гифой, которая проникает в ткани и разрушает клетки, вызывая их гниение. Мицелий многоклеточный, споры образуются экзогенно на конидиеносцах, которые отрываются целиком. Склеротиния на овощах и фруктах образует подушечки сероватого цвета (конидиальные спороношения).
Для изучения гриба берут покрытые белым пушком плесени яблоко или морковь и иголкой снимают немного налета. Готовят препарат методом раздавленной капли и рассматривают под микроскопом. Так же, как и при рассмотрении других препаратов, диафрагма микроскопа должна быть немного прикрыта, при этом неокрашенный препарат виден лучше. Препарат зарисовывают.
Лучистый грибок (Actinomyces griseus) имеет хорошо выраженный, очень тонкий ветвящийся несептированный мицелий. Мицелий проникает в субстрат, образуя плотную пластинку, вследствие чего его трудно отделить. На поверхности субстрата образуется воздушный мицелий, который может быть пушистым или мучнистым. На гифах мицелия образуются спорангиеносцы - спиральные или прямые, одиночные или собранные в метелки. Тип спорангиеносца - хороший систематический признак для ак- тиномицетов. Актиномицеты широко распространены в природе (почве, воде, иле), среди них встречается много видов патогенных, вызывающих актиномикоз - заболевание животных и человека. Они поселяются на семенах злаков, дают споры, которые, попадая в организм человека, вызывают заболевание.
Есть виды, образующие антибиотические вещества. Так, Actinomyces griseus синтезирует стрептомицин - антибиотик, широко используемый в медицине.
Из чистой культуры Actinomyces griseus готовят препарат методом раздавленной капли. Накрывают его покровным стеклом и рассматривают под микроскопом при большом увеличении.
Для получения препарата культуру Actinomyces griseus надо брать вместе с кусочками питательной среды, так как отделить культуру от субстрата очень трудно. Препарат зарисовывают.
Для работы можно использовать и другие виды актиномицетов: Actinomyces albus, A. bovis, A. citreus, A. chromogenes, A. longisporus, которые различаются по цвету колоний и форме спорангиеносцев.
Контрольные вопросы
1. Как происходит заражение картофеля фитофторой?
2. Какие заболевания могут вызывать некоторые виды гриба фузари- ум? Какое строение имеют конидии этого гриба?
3. Какова роль ризоморф у гриба ризопус?
4. Какое практическое значение имеют некоторые виды актиномицетов?