Методы исследования клеточного состава крови

Метод подсчета количества эритроцитов.

Наиболее распространен классический микроскопический метод подсчета клеток в камере Горяева.

Принцип: Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве

квадратов счетной сетки с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из

объёма квадратов и разведения крови.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для чего в пробирку с

4 мл 0,9% раствор хлорида натрия добавляют 20 мкл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки.

Пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента подсчета. К счетной камере притирают шлифовонное стекло и заполняют ее разведенной кровью.

Предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем стеклянной или пластиковой пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного

стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила

всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру

оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания эритроцитов).

Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т.е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах

сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы не считать одни и те же

эритроциты, лежащие на линиях, принято считать клетки только на определенных двух линиях (например, на левой и верхней).

Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения

крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата

(1/4000 мкл), по формуле:

где Х - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов.

Эритроциты рекомендуется считать в течение 2-З часов после взятия крови. При гемолитических и мегалобластных анемиях - сразу после взятия, так как

эритроциты легко разрушаются.

Ручные методы подсчета клеток чрезвычайно трудоемки и не всегда дают

достаточно точные результаты, так как при визуальном подсчете постоянно

присутствует субъективный фактор. Кроме того, малейшие отклонения от правил подготовки камеры и подсчета клеток влияют на конечный результат

исследования. Вместе с тем, эти методы не требуют сложного оборудования,

реактивов и могут быть применены практически в любых условиях.

Метод подсчета количества лейкоцитов.

Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови.

Реактивы: 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого цвета, длительно годен к употреблению.

Ход определения: В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20 мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки, затем тщательно перемешивают, повторно ее набирая и выдувая. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов проводят по всей сетке в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и полосы), начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму.

Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:

где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших

квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250

—объем одного большого квадрата 1/250.

Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50.

Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере:

• Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку.

• Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации

большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к

занижению результата).

•Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата.

•Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов,

камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток.

•Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева.

Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.

Методы подсчета количества тромбоцитов.

Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счетной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки.

Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови.

Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови.

Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему.

Метод подсчета в камере.

Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов.

Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике.

Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру.

Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах.

Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований.

Расчет тромбоцитов проводят по формуле:

где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в

25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных

квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000.

Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%.

Метод подсчета в мазках крови (по Фонио).

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках

крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА).

Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75” и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”.

Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и

окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно).

Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов.

Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови.

Например: А=60‰; число эритроцитов 5 ×10¹²/л

Составляют пропорцию: 60 - 1000

Х - 5×10¹²/л, откуда

Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0×10⁹/л

В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов.