![]() |
![]() |
Категории: АстрономияБиология География Другие языки Интернет Информатика История Культура Литература Логика Математика Медицина Механика Охрана труда Педагогика Политика Право Психология Религия Риторика Социология Спорт Строительство Технология Транспорт Физика Философия Финансы Химия Экология Экономика Электроника |
Методы исследования клеточного состава кровиМетод подсчета количества эритроцитов. Наиболее распространен классический микроскопический метод подсчета клеток в камере Горяева. Принцип: Подсчет эритроцитов под микроскопом в определенном количестве квадратов счетной сетки с последующим пересчетом на 1 мкл крови, исходя из объёма квадратов и разведения крови. Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз, для чего в пробирку с 4 мл 0,9% раствор хлорида натрия добавляют 20 мкл крови. Кончик пипетки вытирают фильтровальной бумагой или марлей, и кровь выдувают на дно пробирки. Пипетку тщательно промывают в верхнем слое жидкости, содержимое пробирки перемешивают и оставляют стоять до момента подсчета. К счетной камере притирают шлифовонное стекло и заполняют ее разведенной кровью. Предварительно несколько раз тщательно встряхивают содержимое пробирки, затем стеклянной или пластиковой пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой отбирают каплю разведенной крови и подносят ее к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы она равномерно без пузырьков воздуха заполнила всю поверхность камеры с сеткой, не затекая в бороздки. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания эритроцитов). Подсчет эритроцитов производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 малых, т.е. в 80 малых квадратах. Рекомендуется считать клетки в квадратах сетки, расположенных по диагонали. Для того чтобы не считать одни и те же эритроциты, лежащие на линиях, принято считать клетки только на определенных двух линиях (например, на левой и верхней). Расчет количества эритроцитов в 1 мкл крови производят, исходя из разведения крови (200), числа сосчитанных квадратов (80) и объема 1 малого квадрата (1/4000 мкл), по формуле: где Х - число эритроцитов в 1 мкл крови; а - число сосчитанных эритроцитов. Эритроциты рекомендуется считать в течение 2-З часов после взятия крови. При гемолитических и мегалобластных анемиях - сразу после взятия, так как эритроциты легко разрушаются. Ручные методы подсчета клеток чрезвычайно трудоемки и не всегда дают достаточно точные результаты, так как при визуальном подсчете постоянно присутствует субъективный фактор. Кроме того, малейшие отклонения от правил подготовки камеры и подсчета клеток влияют на конечный результат исследования. Вместе с тем, эти методы не требуют сложного оборудования, реактивов и могут быть применены практически в любых условиях. Метод подсчета количества лейкоцитов. Определение количества лейкоцитов в счетной камере: Подсчет лейкоцитов под микроскопом проводят после лизирования эритроцитов в 100 больших квадратах счетной сетки и пересчитывают на 1 л крови, исходя из объема квадратов и разведения крови. Подсчет лейкоцитов должен быть произведен в течение 2-4 ч после взятия крови. Реактивы: 3-5% раствор уксусной кислоты, подкрашенный несколькими каплями раствора метиленового синего (для окраски ядер лейкоцитов). Раствор голубого цвета, длительно годен к употреблению. Ход определения: В пробирку с 0,4 мл уксусной кислоты набирают из пальца 20 мкл крови (разведение 1:20). Можно использовать стабилизированную антикоагулянтом венозную кровь. Выдувают кровь из пипетки на дно пробирки, затем тщательно перемешивают, повторно ее набирая и выдувая. Заполненную камеру оставляют в горизонтальном положении на 1 мин (для оседания лейкоцитов). Лейкоциты подсчитывают в 100 больших квадратах с малым увеличением (окуляр 10х, объектив 8х). Для большей точности счет лейкоцитов проводят по всей сетке в больших квадратах (неразделенных на малые квадраты и полосы), начиная с левого верхнего угла сетки. Для лучшего контрастирования затемняют поле зрения, опуская конденсор и закрывая диафрагму. Расчет числа лейкоцитов проводят по формуле:
где Х — число лейкоцитов в 1 мкл крови, а - число лейкоцитов в 100 больших квадратах, 20 — разведение крови, 100- число подсчитанных квадратов, 250 —объем одного большого квадрата 1/250. Таким образом, количество лейкоцитов, подсчитанных в 100 больших квадратах, умножают на 50. Основные источники ошибок при подсчете лейкоцитов в камере: • Неправильное соотношение объемов крови и уксусной кислоты, взятые в пробирку. • Неправильно подготовленный раствор уксусной кислоты (при концентрации большей, чем 5%, часть лейкоцитов может лизироваться, что приведет к занижению результата). •Длительное нахождение пробы при температуре выше 28°С, что может ускорить лизис лейкоцитов в образце и привести к занижению результата. •Неправильное заполнение камеры Горяева. Как и при подсчете эритроцитов, камеру необходимо оставлять на 1 минуту для оседания клеток. •Недостаточно хорошо отмытая после предыдущего определения камера Горяева. Оставшиеся в камере лейкоциты могут завышать результаты анализа.
Методы подсчета количества тромбоцитов. Для определения количества тромбоцитов используют следующие методы: подсчет в счетной камере, мазках крови и гематологическом анализаторе. Каждая группа методов имеет преимущества и недостатки. Подсчет тромбоцитов в камере достаточно точен, не требует для расчета количества эритроцитов. С другой стороны этот метод более трудоемкий, поскольку тромбоциты в нативном виде представлены мелкими и плохо контрастированными элементами. Недостаток метода в необходимости подсчета тромбоцитов в ближайшие часы после взятия крови. Определение количества тромбоцитов в мазках крови значительно уступает по своей точности камерному методу или автоматическим счетчикам. Ошибки при подсчете в мазках крови могут быть обусловлены плохим качеством мазка и связанным с этим неравномерным распределением тромбоцитов, неточным определением количества эритроцитов крови. Существенное неудобство метода - необходимость одновременного подсчета тромбоцитов и эритроцитов в крови. Преимущество его - возможность исследования тромбоцитов в любое время, независимо от момента взятия крови. Метод определения тромбоцитов с помощью гематологического анализатора позволяет достаточно точно определить количество тромбоцитов, их средний объем и распределение по объему. Метод подсчета в камере. Принцип: Определение количества тромбоцитов в 1 л крови с учетом ее разведения и объема квадрата счетной сетки камеры Горяева с применением фазово-контрастного устройства для контрастирования тромбоцитов. Реактивы: Применяют 1% раствор оксалата аммония, который быстро и полностью лизирует эритроциты. Раствор кипятят и фильтруют. Хранят в холодильнике. Ход определения: Исследуемую кровь разводят в 200 раз; для этого в сухую пробирку набирают 4 мл реактива и 0,02 мл крови. Перемешивают и оставляют на 25-30 мин для гемолиза эритроцитов. Подготавливают счетную камеру. Перемешивают разведенную кровь и заполняют камеру: подносят каплю крови с помощью стеклянной палочки или пастеровской пипетки к краю покровного стекла, следя за тем, чтобы кровь равномерно без пузырьков воздуха заполняла всю поверхность сетки, не затекая в бороздки. Помещают счетную камеру во влажную камеру на 5 мин для оседания тромбоцитов (чашка Петри с уложенной по краям смоченной водой фильтровальной бумагой). Подготавливают фазово-контрастное устройство в соответствии с инструкцией, приложенной к нему. Тромбоциты считают в 25 больших квадратах. Тромбоциты выглядят в счетной камере в виде мелких, хорошо преломляющих свет образований. Расчет тромбоцитов проводят по формуле:
где Х - число тромбоцитов в 1 мкл крови; а - число тромбоцитов, сосчитанных в 25 больших квадратах, 200 - разведение крови, 25 - число сосчитанных квадратов, 250 - объем одного большого квадрата 1/250 мкл. Число подсчитанных тромбоцитов умножают на 2000. Воспроизводимость. Ошибка метода составляет 6,5%. Метод подсчета в мазках крови (по Фонио). Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов. Реактивы: Применяют 14% раствор сульфата магния или 6% раствор этилендиаминтетраацетата натрия (ЭДТА). Ход определения: Реактив набирают в капилляр Панченкова до метки “75” и вносят в пробирку, затем добавляют кровь, взятую тем же капилляром, до метки “0”. Содержимое пробирки перемешивают и готовят тонкие мазки. Фиксируют и окрашивают по Романовскому-Гимзе в течение 2-3 ч (при использовании раствора сульфата магния) и в течение 30-45 мин (при приме нении ЭДТА). Высохшие мазки микроскопируют с иммерсионным объективом, подсчитывая количество тромбоцитов в тонких местах препарата (эритроциты должны быть расположены разрозненно). Подсчет проводят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Расчет: количество тромбоцитов на 1000 эритроцитов составляет А‰ Зная число эритроцитов в 1 л крови, подсчитывают количество тромбоцитов в 1 л крови. Например: А=60‰; число эритроцитов 5 ×1012/л Составляют пропорцию: 60 - 1000 Х - 5×1012/л, откуда
Нормальные величины тромбоцитов 180,0-320,0×109/л В настоящее время существуют готовые наборы для подсчета тромбоцитов. |