Определение активности сукцинатдегидрогеназы в мышцах. Количественное определение пирувата в моче
А. Определение активности сукцинатдегидрогеназы мышц
Сукцинатдегидрогеназа (СДГ, КФ: 1.3.99.1) – единственный фермент цикла трикарбоновых кислот Кребса, прочно связанный с внутренней мембраной митохондрий (комплекс II). Коферментом СДГ служит ФАД, акцептирующий два атома водорода от молекулы сукцината и переносящий их непосредственно на коэнзим Q (убихинон) в дыхательной цепи митохондрий. ФАД прочно связан с молекулой СДГ.
Цель работы
Убедиться в способности сукцинатдегидрогеназы мышечной ткани проявлять активность в анаэробных условиях.
Принцип метода
Доказательством проявления активности СДГ может служить изменение окраски искусственного акцептора водорода метиленового синего:
Выполнение работы
Так как восстановленная форма метиленового синего вновь окисляется на воздухе, опыт проводят в анаэробных условиях, предотвращая доступ кислорода наслаиванием на поверхность пробы вазелинового масла. Контролем служит гомогенат мышц, в котором СДГ инактивирована кипячением. Критерием активности СДГ служит время обесцвечивания опытной пробы в присутствии сукцината в анаэробных условиях.
| Реагенты, этапы | Опыт | Контроль |
| Гомогенат мышц (мясной фарш), мл | ||
| Нагревают при 100°С в течение 5 минут на водяной бане, а затем охлаждают до комнатной температуры | — | + |
| 0,05 М Фосфатный буфер, рН 6,8, мл | ||
| 5 мМ Сукцинат, мл | ||
| Метиленовый синий, 0,05% раствор, капли | ||
| Пробы тщательно перемешивают стеклянной палочкой, заливают вазелиновым маслом и инкубируют при комнатной температуре | ||
| Окраска | ||
| Время обесцвечивания |
Выводы
Б. Количественное определение пировиноградной кислоты в моче
ПВК является промежуточным продуктом распада углеводов в организме. Она содержится во всех органах и тканях.
Клинико-диагностическое значение
Содержание ПВК в крови и моче возрастает при сахарном диабете, сердечной недостаточности, гиперфункции гипофизарно-адреналовой системы, токсикозах, при введении некоторых лекарственных средств, а также при недостаточности тиамина.
Цель работы
Определить количество пировиноградной кислоты и сравнить полученные результаты с нормой.
Принцип метода
Пировиноградная кислота, взаимодействуя с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-ДНФ-гидразин), в щелочной среде образует 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты жёлто-оранжевого цвета, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации пировиноградной кислоты.
Реакция протекает по уравнению:
| ПВК | 2,4-ДНФ-гидразин | 2,4-ДНФ-гидразон пировиноградной кислоты |
Выполнение работы
| Реагенты, этапы | Опыт | Контроль |
| Моча, мл | — | |
| H2O, мл | — | |
| Спиртовой раствор КОН (2,5%), мл | ||
| Перемешивают в течение 1 минуты | ||
| 2,4-ДНФГ (0,1% раствор в 2 М НС1, мл | 0,5 | 0,5 |
| Инкубируют 15 мин при комнатной температуре | ||
| Фотометрируют против Н2О (l = 490 нм, толщина кюветы 0,5 см). D490 | ||
| Dоп - Dк |
Строят калибровочный график зависимости D490 от содержания ПВК.