СТРОЕНИЕ, СВОЙСТВА, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ. Нуклеиновые кислоты являются биологическими полимерами

НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ

Нуклеиновые кислоты являются биологическими полимерами. Мономерными звеньями ДНК и РНК являются нуклеотиды – фосфорные эфиры нуклеозидов. В природе существует два типа нуклеиновых кислот: ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) и РНК (рибонуклеиновая кислота).

Мономерные остатки в нуклеиновых кислотах связаны фосфодиэфирными связями. Как в ДНК, так и в РНК эта связь осуществляется только за счет 3′-ОН-группы одного нуклеотидного остатка и 5′-ОН-группы другого (рис. 11.1). Такую межнуклеотидную связь называют 3′,5′-фосфодиэфирной.

Цепи ДНК и РНК обладают определенной полярностью или направлением, поскольку все межнуклеотидные фосфодиэфирные связи ориентированы вдоль цепи одинаково. Благодаря полярности каждая полинуклеотидная цепь имеет 5′-конец и 3′-конец. Из-за наличия 2′-ОН группы у рибозы межнуклеотидные связи в РНК значительно лабильнее, чем в ДНК; они легко гидролизуются в присутствии щелочи.

Рис. 11.1. Фосфодиэфирная связь в молекуле ДНК

В настоящее время разработаны и с успехом применяются способы определения нуклеотидной последовательности ДНК и РНК. Исходную молекулу ДНК предварительно фрагментируют с помощью рестриктаз. При этом осуществляют независимое расщепление ДНК двумя и более рестриктазами, в результате чего образуются перекрывающиеся фрагменты. Это позволяет после определения нуклеотидной последовательности соответствующих фрагментов реконструировать первичную структуру всей ДНК.

Существует два принципиально различных подхода к определению первичной структуры ДНК. В основе первого лежат химические реакции, в которых используются непосредственно фрагменты очищенной ДНК, во втором случае используют ДНК-копии очищенных сегментов, полученных ферментативным путем. Оба метода полностью автоматизированы. При секвенировании ДНК по методу Ф. Сэнгера вводят флуоресцентные метки, причем для каждого из четырёх анализируемых нуклеотидов используются флуоресцирующие агенты с различными спектральными характеристиками, что позволяет сканировать гели при различных длинах волн и передавать информацию непосредственно в компьютер.

В методе А. Максама и У. Гилберта используется химическое секвенирование, основанное на химической модификации пуриновых и пиримидиновых оснований с последующим выщеплением модифицированных нуклеотидов из полимерной цепи и анализом образовавшихся продуктов методом гель-электрофореза. В 5′-конец анализируемого участка ДНК, с использованием фермента полинуклеотидкиназа из фага g-32Р (АРФ) вводится радиоактивная метка. Сразу после введения метки одноцепочечные фрагменты секвенируют, а двуцепочечные с помощью денатурации разделяют на отдельные цепи. Далее анализируемый образец разделяют на четыре порции, каждую из которых специфически обрабатывают, приводят к выщеплению определенного вида нуклеотидов. При этом используют диметилсульфат, который метилирует пуриновые основания (аденин по положению N₃, а гуанин по положению N₇), а также гидразин, который расщепляет и модифицирует пиримидиновые основания. Далее, используя обработку пиперидином и гидролиз при различных значениях pH,осуществляют выщепление определенных модифицированных оснований, сопровождающееся разрывом соседних фосфодиэфирных связей. Таким образом, для каждой из четырех анализируемых проб получают набор небольших по размеру фрагментов ДНК, часть из которых несет радиоактивную метку. Все эти фрагменты разделяют методом электрофореза, который позволяет разделять фрагменты, отличающиеся по длине на один нуклеотид. Полученные электрофореграммы проявляют с помощью рентгеновской пленки. В результатев выявляяются только радиоактивные фрагменты, по которым и определяют нуклеотидную последовательность анализируемой ДНК.

Итак, первичная структура нуклеиновых кислот – это порядок чередования нуклеотидных остатков в полинуклеотидной цепи.

Вторичная структура первоначально была предложена Дж. Уотсоном и Ф. Криком (1953 г.). В основу организации этой вторичной структуры легли установленные закономерности химического состава ДНК (правило Чаргаффа): молярное содержание в ДНК пуринов равно содержанию пиримидинов, а именно содержание аденина равно содержанию тимина А/Т=1; суммарное содержание аденина и гуанина равно суммарному содержанию цитозина и тимина − (А+G)=(C+Т), (А+G)/(C+Т)=1; количество 6-аминогрупп, входящих в состав оснований ДНК (аденин и цитозин), равно количеству 6-кетогрупп имеющихся оснований (гуанин и тимин).

Рентгенограммы волокон ДНК указывали на то, что молекула ДНК обладает спиральной структурой и содержит более одной полинуклеотидной цепи. Кислотно-щелочное титрование показывало, что её структура стабилизирована водородными связями.

На основании этих данных Дж. Уотсон и Ф. Крик предложили трехмерную модель ДНК (рис. 11.2). Согласно их модели ДНК представляет собой правильную правовинтовую спираль, образованную двумя полинуклеотидными цепями, закрученными друг относительно друга и вокруг воображаемой оси. Полинуклеотидные цепи антипараллельны, т.е. если одна из них ориентирована в направлении 3′–5′, то вторая – в направлении 5′–3′. Поэтому на каждой из концов молекулы ДНК расположены 5′-конец одной цепи и 3′-конец другой цепи.

Все азотистые основания цепей расположены внутри двойной спирали, а пентозофосфатный остов – снаружи. Полинуклеотидные цепи удерживаются относительно друг друга за счет водородных связей, которые образуются между аденином одной цепи и тимином другой. При этом образуеюся две водородные связи: одна – между амино- и кетогруппами, другая – между двумя атомами азота пурина и пиримидина соответственно. Между гуанином и цитозином образуеюся три водородные связи: две из них – между амино- и кетогруппами соответствующих оснований, третья – между атомами азота пурина и пиримидина. В связи с этим последовательность в одной цепи определяет их последовательности в другой. Это и есть принцип комплементарности – ключевое свойство ДНК. При таком сочетании оснований в полинуклеотидных цепях каждая пара содержит по три кольца, поэтому общий размер этих пар оснований одинаков по всей длине молекулы.

Диаметр спирали постоянен вдоль всей её длины и равен 2,0 нм. Пуриновые и пиримидиновые основания обеих цепей стекинг – взаимодействиями уложены в «стопки» с интервалом 0,34 нм; плоскости колец слегка смещены относительно друг друга. Полный оборот спирали (длина витка спирали), который соответствует её периоду идентичности, равен 3,40 нм. На один виток спирали приходится 10 нуклеотидных остатков в одной цепи. В образованной структуре различают две бороздки: – большую шириной 2,2 нм; малую шириной 1,2 нм. Азотистые основания в области большой и малой бороздок взаимодействуют со специфическими белками, участвующими в организации хроматина.

Рис. 11.2. Двойная спираль ДНК (по Дж.Уотсону и Ф. Крику)

Молекулы ДНК могут находиться в различных конформационных состояниях в зависимости от степени обводненности биомолекулы, ионной силы окружающей среды, типов катионов, а также температуры.

Правозакрученные спирали образуют два семейства: А-семейство и В-семейство. А-семейство ДНК представлено так называемой А-формой ДНК, изученной Р. Франклиным и выделенной при малой влажности. Эта полиморфная форма ДНК имеет С_3′-эндоконформацию сахара, что приводит к уменьшению расстояния между фосфатными группами и, следовательно, уменьшению расстояния между нуклеотидными парами вдоль оси спирали. Это в свою очередь ведет к увеличению количества нуклеотидов на витке спирали (11 нуклеотидных остатков на витке вместо десяти). Пары оснований в А-форме образуют с осью спирали угол около 20˚ и очень сильно отодвинуты от оси спирали к периферии молекулы: сдвиг достигает 0,4-0,5 нм т.е. почти половины радиуса. Вследствие этого А-форма ДНК при взгляде сверху ‒ вдоль оси спирали выглядит, как труба. В А-форме ДНК в стекинге участвуют основания, принадлежащие разным цепям, т.е. имеет место как одно-, так и двуцепочечный стекинг. Это связано с величиной угла наклона плоскостей оснований к оси спирали и углом поворота оснований вокруг оси спирали. В настоящее время доказано наличие А-формы ДНК у некоторых бактерий, превращающихся в споры в неблагоприятных условиях и способных находиться в таком состоянии до тех пор, пока не появятся условия для размножения. Их ДНК окружена споровыми белками и находится в А-форме, что придает ей большую (примерно в 10 раз) устойчивость к действию ультрафиолетового излучения, по сравнению с ДНК, в других формах. Эти исследования подтвердили биологическую значимость А-формы ДНК (рис.11.3).

а б в

Рис. 11.3. Формы ДНК: а – А-ДНК, б – В-ДНК, в – Z-ДНК

Для В-форм ДНК характерно структурное разнообразие. Формы ДНК со случайными последовательностями могут находиться в В-, С-, D- и других конформационных состояниях при разных концентрациях ионов и температуры. Между этими различными формами осуществляются взаимные переходы, что обуславливается различиями в степени обводненности биомолекулы и ионной силы окружающей среды.

Считают, что разные формы ДНК соответствуют различным функциональным состояниям. Так, А-форма характерна для процессов транскрипции; в репликативных процессах ДНК находится в В-форме; С-форма наиболее подходит для «упаковки» ДНК в надмолекулярные структуры и образования различных состояний хроматина, в том числе и для хранения информации.

Z-форма ДНК имеет левозакрученную спираль и обнаружена у полинуклеотида с чередующейся последовательностью (dG-dC). Особенность Z-формы состоит в чередовании конформаций нуклеотидных остатков ‒ син- и антиконформаций нуклеотидов. Стекинг оснований обладает новыми, характерными лишь для этой спирали свойствами. Он имеет место между остатками цитозина противоположных цепей, а остатки гуанина вообще не взаимодействуют, а контактируют с соседними атомами дезоксицитидина. Фосфаты в Z-форме не эквивалентны друг другу. Фосфатный радиус спирали (расстояние фосфата до оси спирали) у d(CpG) равен 0,62 нм, у d(GpC) – 0,76 нм. Соседние сахара ориентированы в противоположные стороны, отчего линия, последовательно соединяющая атомы фосфора в цепи, приобретает зигзагообразный вид. Возможны переходы ДНК из В-формы в Z-форму.

Область перехода перемещается вдоль спирали в виде небольшой петли. Переход В-формы ДНК в Z-форму на небольшом участке молекулы ДНК оказывает очень сильное влияние на топологию сверхспиральной ДНК и используется клеткой в процессе экспрессии генов.

С помощью антител удалось обнаружить Z-форму ДНК в междисковых областях политенных хромосом. Вероятно, Z-форма ДНК выполняет какую-то регуляторную роль в функциональных состояниях ДНК, поскольку возможны и обратные переходы из Z-формы в В-форму. Каждая форма ДНК имеет бороздки определенного размера. У Z-формы есть только один малый желобок, через который проходит ось спирали; он глубокий и узкий, с двух сторон ограничен фосфатными группами. Внутри двойной спирали – конформационная микрогетерогенность.

Каждая форма ДНК имеет малую и большую бороздки определенных размеров. С различными размерами желобков связана специфическая способность форм ДНК к комплексообразованию. В большей степени, чем другие участки молекулы ДНК, бороздки доступны молекулам воды и ионам металлов. Стабилизирующее действие молекул воды направлено на усиление стэкинг-взаимодействий; в случае ослабления последних молекулы воды конкурентно взаимодействуют с протонно-донорными и протонно-акцепторными центрами оснований, дестабилизируя двойную спираль. Гидратация ДНК играет важную роль в превращении А-формы в В-форму, и наоборот. Катионы связываются в основном с пентозофосфатным остовом, располагаясь преимущественно в малом желобке двойной спирали. Всё это подчёркивает динамичность структуры ДНК и возможность конформационных переходов в ней под действием агентов окружающей среды.

Биспиральные структуры в молекуле ДНК могут возникнуть и в пределах одной полидезоксирибонуклеотидной цепи. Для этого в последовательности ДНК должны присутствовать инвертированные, или палиндромные, повторяющиеся последовательности длиной от нескольких до многих тысяч пар оснований. Благодаря наличию собственной симметрии второго порядка палиндромы могут создавать « шпилечные» структуры крестообразной формы, которые обеспечивают специфические нуклеиново-белковые взаимодействия и, возможно, участвуют в процессах регуляции.

Некоторые характеристики различных форм ДНК приведены в табл. 11.1.

Таблица 11.1

Характеристика некоторых форм ДНК

Показатель	А-форма	В-форма	С-форма	D-форма	Z-форма
Число пар нуклеотидных остатков на виток			9,3	8,0
Угол наклона плоскостей оснований к оси спирали, гр.		-2	-6	-6	-7
Угол поворота оснований вокруг оси спирали, гр.	32,7		38,6	45,0	-30,0
Расстояние от комплементарных пар до оси спирали, нм	0,425	0,063	0,213	0,143	-
Расстояние между нуклеотидными остатками по высоте спирали, нм	0,256	0,338	0,332	0,304	0,340
Угол между плоскостями комплементарных оснований, гр.				-	-
Конформация дезоксирибозы	С₃_’-эндо	С₂_’-эндо	С₂_’-эндо	С₂_’-эндо	С₂_’-,С₃_’-эндо

Суперспирализация ДНК формирует третичную структуру, которая образуется с помощью разнообразных белков. Все связывающиеся белки с ДНК эукариот можно разделить на гистоновые и негистоновые. Белковый кор образуется при взаимодействии гистонов Н2А, Н2В, Н3 иН4 в виде октамера и называется «нуклеосомный кор». Молекула ДНК «накручивается» на поверхность гистонового октамера длиною в 146 нуклеотидных пар, что составляет 1,75 оборота. Такой комплекс белков с ДНК служит основной структурной единицей хроматина и носит название «нуклеосома» (рис. 11.4).

ДНК, располагающуюся между нуклеосомами, называют линкерной ДНК. Её длина около 60 нуклеотидных пар. Молекулы гистона Н1 «подтягивают» отдельные нуклеосомы и тем самым укорачивают размеры ДНК в семь раз. Такие архитектурные образования защищают ДНК от воздействия нуклеаз.

Рис. 11.4. Нуклеосомный уровень организации ДНК

Дальнейшие уровни компактизации молекулы ДНК происходят с участием негистоновых белков; при этом каждый белок комплементарен определенной последовательности нуклеотидов ДНК (сайт ДНК). К этой группе относят семейство сайтспецифических белков типа «цинковые пальцы». Каждый «цинковый палец» узнает определенный сайт, состоящий из пяти нуклеотидных пар.

Другое семейство сайт-специфических белков – гомодимеры. Фрагмент такого белка, контактирующего с ДНК, имеет структуру «спираль-поворот-спираль». К группе структурных и регуляторных белков относятся белки высокой подвижности (HMG-белки), которые постоянно ассоциированы с хроматином. Для них характерна маленькая молекулярная масса и высокое содержание заряженных аминокислот. К негистоновым белкам относятся ферменты репликации, транскрипции, трансляции. При участии структурных, регуляторных белков и ферментов, участвующих в синтезе ДНК и РНК, нить нуклеосом преобразуется в высококонденсированную, нуклеопротеиновую структуру – хромосому, которая в 10000 раз короче исходной молекулы ДНК. Основной функцией ДНК является хранение и передача наследственной информации в ряду поколений.

В цитоплазме клеток присутствуют три типа РНК: – транспортные (тРНК), матричные (мРНК) и рибосомальные (рРНК). Они различаются по первичной структуре, молекулярной массе, конформации, продолжительности жизни и выполняемым функциям.

Первичная структура РНК – порядок чередования рибонуклеозидмоно фосфатов в полинуклеотидной цепи. Нуклеотиды в РНК, как и в ДНК связаны 3′,5′-фосфодиэфирными связями. На одном конце полинуклеотидной цепи находится фосфорилированная ОН-группа 5′- углеродного атома, на другом – ОН-группа 3′-углеродного атома рибозы. Гидроксильная группа у 2′-углеродного атома рибозы делает молекулу РНК нестабильной. Для всех типов РНК характерно наличие специализированных участков. Отдельные участки РНК за счет водородных связей с комплементарными азотистыми основаниями образуют петли – «шпильки». Участки цепи РНК спиральных структурах антипараллельны, но не всегда полностью комплементарны. В них встречаются неспаренные нуклеотидные остатки или даже одноцепочечные петли, не образующие двойную спираль.

Транспортные РНК

Независимо от различий в последовательности нуклеотидов, пространственная структура любых тРНК описывается универсальной моделью «клеверного листа». Последовательность тРНК включают 70-90 нуклеотидов и около 10% минорных компонентов. Структура «клеверного листа» состоит из четырех или пяти двуцепочечных спиральных стеблей и трех петель (рис. 11.5).

Каждый стебель содержит 4-7 пар комплементарных оснований. Различают акцепторный, антикодоновый, дигидроуридиловый, псевдоуридиловый и добавочный «стебли». Акцепторный «стебель» содержит 3′- и 5′-концы полинуклеотидной цепи. К 3′-концу, оканчивающемуся CCA-ОН, присоединяется специфическая аминокислота, отвечающая последовательности антикодонового триплета в антикодоновой петле. Число нуклеотидов в «стеблях» и петлях, кроме вариабельной петли, постоянно (от 4 до 21 нуклеотида). Разные тРНК содержат инвариантные основания (присутствуют во всех тРНК), ответственные в «третичных» взаимодействиях за образование Г-образной структуры (рис. 11.6).

Г-образная структура состоит из двух спиралей расположенных почти перпендикулярно в А-РНК, длина которой равна около 7 нм, ширина – 2 нм. Одну спираль образуют «уложенные» друг за другом антикодоновый (А) и дигидроуридиловый (D) «стебли», другую – акцепторный и псевдоуридиловый (Т) «стебли». В состав тРНК входят минорные основания, представленные метилированными основаниями, изомерами и аналогами пиримидинов. Минорные основания выполняют две функции: они делают тРНК устойчивыми к действию нуклеаз и поддерживают определенную третичную структуру молекулы, т.к. не участвуют в образовании комплементарных пар и препятствуют спирализации определенных участков тРНК. Антикодон имеет жесткую архитектуру, которая позволяет ему быстро считывать матричную РНК.


Рис. 11.5. тРНК	Рис. 11.6. тРНК (третичная структура)

Матричные РНК

Матричные РНК эукариот и прокариот различаются по строению. Более сложную организацию имеют матричные РНК. Этот тип РНК, независимо от уникальности кодирующих последовательностей нуклеотидов, имеет одинаковое строение 5′- и 3′-концов.

Схема строения матричной РНК эукариот

На 5′ конце присутствует модифицированный нуклеотид 7-метилгуанозин-5′-трифосфат – кэп (от англ. сар – «шапочка», рис. 11.7). Несколько десятков нуклеотидов (5′-нетранслируемая область) отделяют кэп от инициирующего кодона, (обычно это – -AUG-), далее идет кодирующий участок, а за ним следует один из терминирующих кодонов (-UGA-, -UUA-, -UAG -). За стоп-кодоном идет 3′-нетранслируемая область и далее полиаденилатный «хвост», состоящий из 50-400 оснований. Полагают, что полиаденилатная область молекулы мРНК участвует в процессинге мРНК, предопределяет время жизни мРНК, способствует переносу мРНК из ядра в цитоплазму и принимает участие в трансляции. Предполагают, что вторичная (спирализация сама на себя) и третичная структуры менее компактны, чем тРНК и рРНК.

Рис. 11.7. Строение кэпа (И – инвариантный сайт, метилируемый у кэп-групп всех типов, I, II - сайты, метилируемые у кэп-групп типов 1 и 2 соответственно)

Строение прокариотических матричных РНК проще чем у эукариот – отсутствует «кэп» и полиаденилатный «хвост».

Рибосомальные РНК

Они принимают участие в образовании рибонуклеопротеинов, формирующих немембранные комплексы – рибосомы. Клетки прокариот и эукариот содержат рибосомы, имеюшие общий план строения. В рибосомы входят высокомолекулярные рРНК, дающие начало 30S-40S- и 50S-60S-субчастицам рибосом; рРНК взаимодействуют с мРНК и аминоацил-тРНК в процессе трансляции. 5S-рРНК выступает в роли посредника между пептидилтрансферазным центром и доменом белкового фактора трансляции, обладающим GTP-азной активностью.

Рибосомальные РНК содержат несколько модифицированных нуклеотидов. Чаще всего это метильные производные азотистых оснований или рибозы. Вторичная структура рРНК характеризуется спирализацией самой на себя полирибонуклеотидной цепи. Биспиральные и линейные участки этих молекул формируют постоянные вариабельные домены, которые затем укладываются в более компактные структуры более высокого порядка (рис. 11.7).

Рис. 11.7. Рибосомальная РНК

Остановимся на малых ядерных РНК. В ядрах всех эукариотических клеток содержится множество коротких и стабильных молекул РНК. Они локализованы в сплайсосомах млекопитающих и называются U-РНК из-за необычайно большого содержания урацила и его модифицированных форм.

Нуклеотидные последовательности всех U-РНК позвоночных совпадают на 95%. В сплайсосому, кроме пяти типов U-РНК, обладающих ферментативной активностью и названных рибозимами, входят еще 50 типов белков. Характерной чертой рибозимов является наличие липких концов, комплементарных концам интронов. Сплайсосома вырезает интроны – участки первичных транскриптов, не несущих информацию о белке.

В последние годы большой интерес исследователей направлен на изучение феномена малых РНК (siRNA). Различают цитоплазматические и ядерные малые РНК. В класс малых (коротких РНК) включают молекулы, содержащие от 20 до 300 нуклеотидов. Самые короткие из них – siRNA состоят из 21 – 28, а млекопитающих из 21 – 23 нуклеотидов. Особенностью этих молекул является то, что они в отличие от большинства других клеточных РНК, состоящих всего из одной цепи нуклеотидов, являются двунитчатыми. Нуклеотиды с противоположных цепей siRNA спариваются друг с другом по тем же законам комплементарности, которые формируют двунитчатые цепи в ДНК. Кроме того, по краям каждой из цепей siRNA всегда остаются два неспаренных нуклеотида.

Ядерным малым РНК отводится способность подавлять экспрессию генов у животныъх и растений. Эффект «гашения» определенных генов малыми РНК получил в молекулярной биологии название РНК-интерференции. Имеются доказательства, что у растений и низших животных организмов siRNA являются элементами «внутриклеточного иммунитета», позволяют быстро распознать и уничтожить чужую РНК.

ЛЕКЦИЯ 12

⇐ Назад