МОДУЛЬ III. МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
ЛЕКЦИЯ 29
РЕПЛИКАЦИЯ ДНК
Согласно гипотезе Дж.Уотсона и Ф.Крика, каждая из цепей двойной спирали ДНК служит матрицей для репликации комплементарных дочерних цепей. При этом образуются две дочерние двухцепочечные молекулы ДНК, идентичные родительской, причем каждая из этих молекул содержит одну неизменную цепь родительской ДНК. Этот механизм репликации ДНК, названный полуконсервативным, был подтвержден в опытах на клетках Е.соli в 1957 г. М. Мезелсоном и Ф. Сталем. Исключены консервативный способ репликации, при котором одна дочерняя ДНК должна содержать обе исходные цепи, а вторая состоять из двух новосинтезированных цепей, и дисперсивный механизм репликации, при котором каждая дочерняя цепь ДНК состоит из участков родительской и новообразованной ДНК (рис.29.1).
Рис.29.1. Три механизма репликации ДНК: а) полуконсервативный; б) консервативный; в) дисперсивный
Для биосинтеза ДНК необходимы:
1) неспаренная цепь ДНК, которая служит матрицей, и цепь-затравка, к которой присоединяются новые нуклеотиды;
2) полный набор дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTP). При отсутствии хотя бы одного из них синтез ДНК не происходит. Цепь удлиняется от затравки, имеющей свободную 3´-ОН, в направлении 5´→3´ (путем присоединения следующего нуклеотида в соответствии с информацией, заложенной в матрице). Источником энергии в реакциях полимеризации мононуклеотидов является энергия, освобождаемая всеми четырьмя типами дезоксирибонуклеозидтрифосфатов, участвующих в синтезе ДНК. Расщепление пирофосфата до неорганического фосфата при участии неорганической пирофосфатазы сдвигает реакцию в сторону удлинения цепи;
3) ферменты и белки, участвующие в синтезе ДНК: ДНК-полимеразы, топоизомеразы (гиразы), хеликазы и лигазы, праймаза, ssb-белки. Весь комплекс, состоящий более чем из 20 репликативных ферментов и факторов, называется ДНК-репликазной системой, или реплисомой.
ДНК-зависимые ДНК-полимеразы – ключевые ферменты репликативного процесса, использующие принцип комплементарности для наращивания полинуклеотидных цепей. У прокариот есть триДНК-полимеразы: Pol I, Pol II и Pol III. В репликации ДНК участвуют Pol I и Pol III. ДНК-полимераза I обладает полимеразной и (3ʹ→5ʹ , 5ʹ→3ʹ)-экзонуклеазной активностью, участвует в удалении праймера, застройке бреши, образовавшейся на месте праймера, коррекции ошибок при репликации, а также в репарации ДНК. В клетках E.coli насчитывается около 400молекул этого фермента. Pol III осуществляет репаративный синтез ДНК.
Основным ферментом, катализирующим биосинтез новообразованной ДНК у прокариот, является ДНК-полимераза III (Pol III).Она обладает полимеразной и 3ʹ→5ʹ- экзонуклеазной активностью; синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией. В клетке содержится 10-20 молекул Pol III, она обладает повышенным сродством к матрице и обеспечивает высокую эффективность копирования. Структура ДНК-полимеразы Ш приведена на рис.29.2.
Рис. 29.2. Субъединичная структура ДНК-полимеразы III
Кор-фермент состоит из субъединиц (αθε), β-белок выполняет функцию «скользящего зажима», τ-белок участвует в сборке и димеризации холофермента ДНК-полимеразы. γ-комплекс (γ,δ,δ´,χ,ψ) – ДНК-зависимая АТРаза, необходим для связывание затравки с матрицей и активации ДНК-полимеразы.
ДНК-полимеразы – это полидезоксирибонуклеотид-синтетазы, ферменты класса трансфераз, катализирующие образование фосфодиэфирной связи при синтезе ДНК: R-цепь ДНК, В, Вʹ- азотистые основания:
Имеются доказательства того, что в димерной форме ДНК-полимераза III катализирует сопряженный синтез ведущей (лидирующей) и отстающей цепей ДНК при репликации. ДНК-полимеразы нуждаются в затравке (праймере), поскольку они могут присоединять дезоксирибонуклеотиды только к 3ʹ-ОН-группе.
Топоизомеразы участвуют в процессе раскручивания двойной спирали в репликативной вилке. Эти ферменты изменяют степень сверхспирализации и приводят к образованию «шарнира», который создает условия для непрерывного движения репликативной вилки. Идентифицированы два типа топоизомераз: топоизомеразы I типа надрезают одну из двух цепей ДНК, в результате чего концевой участок двойной спирали может повернуться вокруг интактной цепи, и затем воссоединяют концы разрезанной цепи. Топоизомеразы типа II вносят временные разрывы в обе комплементарные цепи, изменяют степень сверхспирализации, а затем соединяют разорванные концы. Топоизомеразы помогают хеликазе раскручивать ДНК для ее репликации.
Хеликазы (от лат. helix - спираль, белок dnaB), осуществляют образование и продвижение вдоль спирали ДНК репликативной вилки – участка молекулы с расплетенными цепями. Эти ферменты для расплетения цепей используют энергию, высвобождающуюся при гидролизе АТР. Хеликазы действуют в комплексе с ssb-белками, которые связываются с одноцепочечными участками молекулы и тем самым стабилизируют расплетенный дуплекс.
Праймазы. Репликация ДНК требует РНК-праймеров. РНК-праймеры синтезируются праймазой (рис. 29.3), кодируемой dnaG геном.
Из рис 29.3 видно, что праймаза состоит из трех доменов:
■ – N-терминальный домен (110 аминокислот), содержит ДНК-связывающий мотив -цинковый палец;
■ – коровый (центральный) домен (322 аминокислоты) содержит каталитический центр;
■ – С-терминальный домен (151 аминокислота), взаимодействующий с dnaB.
Рис. 29.3. Праймаза E.coli
Праймеры, синтезируемые праймазой E.coli, начинаются с последовательности pppAG на 5´-конце и состоят примерно из 10-12 нуклеотидов. Праймазы различаются как по структуре, так и по специфичности действия.
ДНК-лигазы катализируют процессы воссоединения фрагментов цепей ДНК, участвуя в образовании ковалентных связей между 5ʹ-Р- и 3ʹ-ОН-группами соседних дезоксирибонуклеотидов. Эти ферменты также используют энергию макроэргических связей, образующуюся при гидролизе АТР.
В таблице 29.1 сведены основные функции ферментов и белков, участвующих в процессе репликации.
Таблица 29.1
Функции белков и ферментов, участвующих в репликации
| Белки, ферменты | Основная функция |
| ДНК-полимераза | Полимеризация дезоксирибонуклеотидов |
| Хеликаза | Раскручивание цепей ДНК |
| Топоизомераза | Релаксация положительной сверхспирализации |
| Праймаза | Синтез РНК-праймера |
| Белок ssb | Препятствуют обратной рекомбинации расплетенных цепей в двойной спирали |
| ДНК-лигаза | Соединяет фрагменты Оказаки на отстающей цепи |
Репликация ДНК идет в три стадии: инициация, элонгация и терминация.
У бактерий инициация репликации ДНК начинается в уникальном сайте хромосомы, точке репликации – oriC, из которой репликация осуществляется двунаправлено до точки окончания (terminus). В результате образуются две репликативные вилки, которые продвигаются в противоположных направлениях, т. е. обе цепи реплицируются одновременно.
Инициаторный белок dnaA связывается с повторяющимися сайтами связывания на oriC, образуя специализированную нуклеопротеиновую структуру. Это приводит к локальному расхождению АТ-богатой последовательности oriC, которая служит зоной связывания для репликативной хеликазы (dnaB), и белка dnaC (рис.29.4).
Рис.29.4. Инициация репликации ДНК
Далее dnaB активируется удалением dnaC, движется на определенное расстояние в направлении 5ʹ→3ʹ и взаимодействует с праймазой dnaG. Праймаза синтезирует короткие РНК-праймеры для холофермента ДНК-полимеразы Ш.
В месте инициации образуется промежуточный комплекс, состоящий по меньшей мере из пяти белков. Один из них – белок dnaB – может передвигаться вдоль ДНК, используя энергию гидролиза АТР, а также служит сигналом для активации праймазы (рис.29.5).
а) б)
Рис. 29.5. Образование репликативной вилки и праймера на лидирующей цепи ДНК (а); переход Pol III вместе с праймазой на отстающую цепь ДНК
Праймаза является компонентом праймосомы, состоящей из нескольких различных субъединиц. В состав праймосомы входит также комплекс белков DnaВ и DnaС, который вблизи репликационной вилки периодически участвует в формировании специфической вторичной структуры ДНК, подходящей для узнавания праймазой.
Инициация репликации ДНК заканчивается образованием репликативной вилки и синтезом РНК-затравки на лидирующей цепи ДНК (рис.29.5) благодаря формированию репликационного комплекса (рис.29.6).
Рис.29.6. Репликационный комплекс E.coli
В процессе элонгации происходит наращивание дочерних полинуклеотидных цепей ДНК. Каждая репликативная вилка включает, по крайней мере, две молекулы ДНК-полимеразы III, ассоциированные с несколькими вспомогательными белками. К последним относятся ДНК-топоизомеразы (гиразы), которые раскручивают плотно свернутую двойную спираль ДНК, и хеликазы,которые расплетают двухтяжевую ДНК на две цепи.
Ведущая цепь ДНК реплицируется непрерывно в направлении, совпадающем с движением репликативной вилки. Отстающая цепь считывается в направлении, противоположном движению репликативной вилки. Преодоление антипараллельности цепей ДНК при репликации, возможно, достигается путем образования петельной структуры (рис.29.7).
Вначале на отстающей цепи синтезируются короткие фрагменты новой цепи ДНК, так называемые фрагменты Оказаки, названные так по имени их первооткрывателя. Каждый фрагмент начинается с короткой РНК-затравки (праймера), необходимой для функционирования ДНК-полимеразы. ДНК-полимераза IIIдостраивает этот праймер до фрагмента ДНК длиной 1000-2000 дезоксинуклеотидных звеньев.
Рис.29.7. Гипотетический механизм преодоления антипараллельностицепей ДНК
Кроме полимеризации цепей, которую осуществляет Рol III, в ходе элонгации ДНК происходят следующие события:
1) вырезание РНК-праймеров из лидирующей цепи и из каждого фрагмента Оказаки. Эту функцию выполняет Pol I, благодаря 5ʹ→3ʹ-экзонуклеазной активности;
2) заполнение брешей, оставшихся после удаления праймеров. В этом процессе участвует также ДНК-полимераза I, используя для встраивания нуклеотидов 3ʹ-ОН-группу соседнего фрагмента Оказаки (рис.29.8);
3) соединение фрагментов ДНК в отстающей цепи с помощью фермента ДНК-лигазы;
4) исправление ошибок репликации, благодаря 3ʹ→5ʹ-экзонуклеазной активности, которой обладают как Pol III, так и Pol I.
Рис.29.8. Механизм действия ДНК-полимеразы I
В целом, последовательность событий, происходящих при репликации ДНК, можно представить в виде следующей схемы (рис.29.9).
Рис.29.9. Основные участники и события репликации ДНК
Терминация синтеза ДНК наступает вследствие исчерпания матрицы. Репликационные «глазки» сливаются, и на каждой матрице образуется дочерняя цепь ДНК.
Точность репликации
Точность в процессе репликации очень важна, т.к. ошибки могут привести к мутациям. ДНК-полимераза III обладает способностью к «редактированию» – исправлению ошибок. По мере продвижения вдоль матричной ДНК-цепи фермент проверяет, нет ли ошибок во вновь синтезированной копии. О наличии ошибок ДНК-полимераза «узнает» по искажению двойной спирали ДНК, которое происходит в том случае, если Т соединится с G или С с А. Обнаружив такой участок, ДНК-полимеразный ферментный комплекс возвращается на один шаг назад и благодаря своей экзонуклеазной активности, вырезает неправильное основание (или их группу) и вставляет то, которое должно быть на этом месте (правильное основание). Скорость точной репликации у бактерий примерно 500 оснований в секунду, а у высших клеток, включая клетки человека, около 50 оснований в секунду.
Репликация ДНК у эукариот
ДНК хромосом высших клеток намного длиннее, а сами хромосомы устроены намного сложнее, чем маленькие и простые бактериальные геномы. У высших клеток, в отличие от бактерий, ДНК в хромосомах образует комплекс с белками (гистонами), которые участвуют в сворачивании длинных нитей ДНК в серию петель для того, чтобы их можно было упаковать внутри ядра. Репликация ДНК начинается одновременно в нескольких сайтах каждой хромосомы. У эукариот число их может превысить 1000, поэтому большой набор ДНК-последовательностей реплицируется за 5-20 часов. Из каждой такой точки в противоположных направлениях одновременно движутся две репликативные вилки. Репликация продолжается до полного завершения синтеза дочерних цепей и разделения новых дуплексов. У млекопитающих и человека известно пять разных ДНК-полимераз. Репликативный синтез ДНК катализируют две ДНК-полимеразы (a и δ); β- и ε-полимеразы участвуют в репарации ДНК, γ-полимераза – в репликации митохондриальной ДНК. Поскольку эукариотическая ДНК линейна, при репликации из-за вырезания праймеров на концах полинуклеотидных цепей образуются недореплицированные участки. Их репликация осуществляется с помощью особого фермента – теломеразы (рис.29.10).
Рис. 29.10. Репликация теломерных участков хромосом
Теломераза, содержащая в себе последовательность нуклеотидов, за несколько приемов удлиняет укороченную цепь, создавая пространство для работы праймазы и ДНК-полимеразы, после чего избытки нуклеотидов удаляются:
Репаративный синтез ДНК
Воздействие на организм неблагоприятных факторов (химические соединения, ультрафиолетовое излучение и др.) приводит к постоянному накоплению ошибок в геноме, которые в конечном итоге вызывают появление патологии, в частности, – невыясненный до сих пор механизм раковых заболеваний. Пока лишь существуют только предположения о том, что причиной раковых заболеваний являются дефекты в носителях информации – ДНК.
Возможны, как минимум, четыре типа повреждений ДНК:
1) повреждение одиночных оснований (жезаминирование цитозина в урацил, аденина в гипоксантин; алкилирование оснований; включение аналогов оснований, инсерции и делеции нуклеотидов и др.);
2) повреждение пары оснований, например, индуцированное ультрафиолетовым излучением образование тиминовых димеров;
3) разрывы цепей при действии ионизирующей радиации;
4) образование перекрестных связей между основаниями, а также между ДНК и белками, например, гистонами.
На рис. 29.11 показано образование пиримидиновых димеров при воздействии ультрафиолетовых лучей..
Рис.29.11. Образование тиминовых димеров в ДНК при ультрафиолетовом облучении
ДНК с таким нарушением уже не может нормально работать. С нее теперь невозможно считать информацию, необходимую для производства белков, или снять копию. Следовательно, процессы жизнедеятельности клетки нарушаются, а деление ее останавливается. Ферменты, ответственные за копирование ДНК и считывание с нее информации, дойдя до тиминового димера, либо «перепрыгнут» через него, что приведет к разрыву синтезируемого белка на две части, либо вовсе остановятся.
В случае такого повреждения репарация начинается с того, что специальный белок, УФ-эндонуклеаза, находит тиминовый димер и рядом с ним разрывает цепь ДНК (рис. 29.12).
Рис.29.12. Репарация тиминовых димеров
При этом вторая цепь остается целой. Затем в работу включается другой белок – экзонуклеаза. Она, отщепляя по одному, удаляет по обе стороны от разрыва несколько сотен нуклеотидов. В результате на цепи ДНК (там, где был обнаружен тиминовый димер) возникает брешь длиной в несколько тысяч нуклеотидов. Эту брешь теперь быстро заделывает третий белок – ДНК-полимераза I (у прокариот) или ДНК-полимераза δ (у эукариот). По принципу комплементарности и на основе информации о второй, нетронутой цепочке ДНК, полимераза встраивает нуклеотиды в первую цепочку. Завершающий этап осуществляет ДНК-лигаза. Она устраняет разрывы на репарированной цепочке ДНК. В результате структура ДНК полностью восстанавливается.
ЛЕКЦИЯ 30
ТРАНСКРИПЦИЯ (БИОСИНТЕЗ РНК)
Транскрипцией называют биосинтез РНК на матрице ДНК. Транскрипция является начальной стадией реализации генетической информации, в процессе которой информация с определенных участков ДНК «переписывается» в комплементарные одноцепочечные молекулы РНК. В результате образуются мРНК, кодирующие аминокислотные последовательности белков, а также тРНК, рРНК и другие виды РНК, выполняющие структурную, регуляторную и каталитическую функции. Основой транскрипции является фундаментальный принцип комплементарности азотистых оснований полинуклеотидных цепей ДНК и РНК.
В отличие от репликации ДНК, тесно связанной с клеточным делением, транскрипция ЛНК происходит практически во всех ядросодержащих клетках, как делящихся, так и неделящихся.
Процесс транскрипции осуществляется ферментами ДНК-зависимыми РНК-полимеразами, которые, как и ДНК-полимеразы, являются нуклеотидилтрансферазами, в качестве субстратов использующими нуклеозид-5ʹ-трифосфаты. РНК-полимеразы проявляют активность только в присутствии ионов Mg2+. В отличие от ДНК-полимераз, РНК-полимеразы не нуждаются в праймере и в качестве субстратов используют рибонуклеозид-5ʹ-трифосфаты (АТР, GTP, CTP, UTP). Как и при синтезе ДНК, в ходе включения рибонуклеозид-трифосфатов в строящуюся цепь они теряют пирофосфатные остатки. Это обеспечивает процесс энергией; поэтому дополнительных ее источников не требуется.
Рост полинуклеотидной цепи идет в направлении 5ʹ→ 3ʹ. Это означает, что рибонуклеозид-5ʹ-трифосфаты присоединяются к 3ʹ-ОН группе рибозы предшествующего нуклеотида. У бактерий один фермент синтезирует все виды РНК, у эукариот разные виды РНК синтезируются различными РНК-полимеразами.
Обычно транскрибируется только одна из комплементарных цепей ДНК; следовательно, для транскрипции характерна асимметричность процесса. Неясно, каким образом осуществляется выбор нужной цепи. Видимо, ключевую роль играют какие-то последовательности нуклеотидов на одной из цепей, узнаваемые РНК-полимеразой. Транскрибируется матричная цепь ДНК. Другая цепь называется кодирующей (смысловой), поскольку ее последовательность идентична последовательности РНК. При этом необходимо помнить о том, что вместо основания Т (тимин) в РНК включается основание U (урацил).
Например, в ДНК:
| Нематричная (кодирующая цепь) | TACGGATA |
| Матричная цепь | ATGCCTAT |
РНК, синтезируемая на основе этого участка:
| UACGGAUA | |
Видно, что синтезированная РНК комплементарна матричной цепи ДНК и идентична кодирующей цепи ДНК.
Для транскрипции характерна консервативность процесса. Молекула ДНК по окончании синтеза РНК возвращается в исходное состояние. При синтезе же ДНК молекулы наполовину обновляются.
Как у про-, так и у эукариот единовременно транскрибируется не вся молекула ДНК, а только ее определенные участки ‒ транскриптоны. В транскриптоне присутствуют последовательности, одна из которых называется промотором (зона начала траскрипции), а другая ‒ терминатором (зона остановки транскрипции). Транскриптоны бактерий называют оперонами. Опероны, как правило, включают в себя нуклеотидные последовательности, кодирующие структуру нескольких белков, называемых структурными генами (цистронами). Поэтому бактериальные мРНК являются полицистронными, в отличие от моноцистронных мРНК высших организмов.
Транскрипция у прокариот
Бактериальные РНК-полимеразы ‒ сложные белки, состоящие из нескольких типов субъединиц. Холофермент Е.соli содержит 5 разных субъединиц: 2 α-субъединицы, β-, βʹ-субъединицу, σ- и ω-субъединицы. Альтернативная форма фермента, лишенная σ-субъединицы, называется мини-ферментом или кор-ферментом. Он способен транскрибировать ДНК в РНК, однако не может инициировать синтез РНК в нужном месте, поскольку не способен узнавать промоторные сайты. Точное связывание и инициация в промоторах происходят только после добавления к кор-ферменту σ-субъединицы и образования холофермента (рис.30.1).
Транскрипция аналогична репликации в том смысле, что порядок присоединения рибонуклеотидов определяется комплементарным спариванием оснований. После формирования первых нескольких фосфодиэфирных связей (обычно 5-10) σ-субъединица отделяется от инициирующего комплекса, а дальнейшая транскрипция осуществляется с помощью кор-фермента.
Рис. 30.1. Общая схема транскрипционного цикла
Как и другие матричные процессы, транскрипция включает три стадии: инициацию, элонгацию и терминацию.
Инициация транскрипции
На этом этапе транскрипции необходимы холофермент, специальная последовательность нуклеотидов в ДНК (промотор) и набор нуклеозидтрифосфатов. Транскрипция инициируется при образовании стабильного комплекса между холоферментом и промотором, расположенным в начале всех транскрипционных единиц.
Промотор ‒ это участок молекулы ДНК, состоящий примерно из 40 пар нуклеотидов и расположенный непосредственно перед участком инициации транскрипции. В нем различают две важные и достаточно консервативные по составу последовательности. Одна из них состоит из шести или семи нуклеотидов (чаще ТАТААТ) и расположена на расстоянии примерно 10 нуклеотидов от первого транскрибируемого нуклеотида (+1); эту последовательность обычно обозначают как ‒10-последовательность, или Прибнов-бокс, (в честь ее первооткрывателя Прибнова). В данном сайте РНК-полимераза связывается с ДНК. Вторая последовательность расположена на расстоянии примерно 35 нуклеотидов до сайта инициации (-35) и служит участком распознавания промотора РНК-полимеразой (рис.30.2).
Рис.30.2. Структура промотора у прокариот
Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК и образование открытого промоторного комплекса (рис.30.3), так называемого транскрипционного «глазок». Благодаря этому нуклеотиды матричной цепи ДНК в области «глазка» становятся доступными для спаривания с рибонуклеозид-трифосфатами.
Рис. 30.3. Схема инициации транскрипции
Происходит копирование последовательности смысловой, или (+)-цепи ДНК, имеющей направление 5ʹ→ 3ʹ. При этом первым в строящуюся цепь РНК всегда включается пуриновый нуклеотид ‒ АТР или GTP, сохраняющий все три его фосфатных остатка. Затем образуется первая 5ʹ,3ʹ-фосфодиэфирная связь. Далее σ-субъединица теряет связь с ферментом, а кор-фермент начинает перемещаться по ДНК.
Элонгация транскрипции
Растущая цепь РНК остается связанной с ферментом и спаренной своим растущим концом с участком матричной цепи. Остальная часть образовавшейся цепи не связана ни с ферментом, ни с ДНК. По мере продолжения транскрипции кор-фермент, движущийся вдоль цепи ДНК, действует подобно застежке «молния», расплетая двойную спираль, которая замыкается позади фермента, и восстанавливается ее исходная дуплексная структура. «Раскрытая» ферментом область ДНК простирается всего на несколько нуклеотидов (рис.30.4).
Наращивание РНК идет в направлении от 5ʹ- к 3ʹ-концу вдоль матричной (‒)-цепи, ориентированной в направлении 3ʹ→5ʹ, т.е. антипараллельно. РНК наращивается на 3ʹ-конце. В ходе присоединением каждого нуклеотида кор-фермент делает шаг по ДНК и сдвигается на один нуклеотид. Размер белкового комплекса, составляющего кор-фермент, 150 Ǻ. Размеры РНК-полимеразы − 150×115×110Ǻ.
Рис. 30.4. Элонгация транскрипции
Скорость работы РНК-полимеразы – до 50 нуклеотидов в секунду. Комплекс кор-фермента с ДНК и РНК называется элонгационным комплексом. В нем находится ДНК-РНК гибрид. Это участок, на котором ДНК спарена с РНК и 3′-конец РНК открыт для дальнейшего роста. Размер этого гибрида – 9 пар оснований. «Расплетенный» участок ДНК занимает примерно 12 пар оснований.
Перед «расплетенным» участком РНК-полимераза связана с ДНК. Этот участок называется передним дуплексом ДНК, его размер – 10 пар оснований. Полимераза связана также с более длинной частью ДНК, называемой задним дуплексом ДНК. Размер матричных РНК, которые синтезируют РНК-полимеразы у бактерий, может достигать 1000 нуклеотидов и больше. В эукариотических клетках размер синтезируемых ДНК может достигать 100000 и даже нескольких миллионов нуклеотидов. Правда, неизвестно, существуют ли они в таких размерах в клетках, или в процессе синтеза могут успеть процессировать.
Элонгационный комплекс довольно стабилен, т.к. должен выполнить большую работу (рис.30.5). Он способен перемещаться по ДНК со скоростью до 50 нуклеотидов в секунду. Этот процесс называется перемещением (или транслокацией). Взаимодействие ДНК с РНК-полимеразой (кор-ферментом) не зависит от последовательности этой ДНК, в отличие от σ-субъединицы. При прохождении определенных сигналов терминации кор-фермент завершает синтез ДНК.
Рис.30.5. Элонгационный косплекс
Терминация транскрипции
Последовательности ДНК, являющиеся сигналами к остановке транскрипции, называются транскрипционными терминаторами. Они содержат инвертированные повторы (GC-богатые участки), благодаря чему 3ʹ-концы РНК-транскриптов складываются с образованием шпилек разной длины. Поскольку сила взаимодействия пар G-C велика, локальная денатурация таких участков в ДНК затруднена. Это замедляет продвижение РНК-полимеразы и может служить для нее сигналом к прекращению транскрипции.
Обнаружены два типа сигналов терминации: ρ-зависимый и ρ-независимый терминаторы (ρ ‒ это олигомерный белок, прочно связывающийся с РНК и в этом состоянии гидролизующий АТР до АDP и неорганического фосфата).
В одной из моделей действие ρ-белка объясняется тем, что он связывается с синтезируемой цепью РНК и перемещается вдоль нее в направлении 5ʹ→ 3ʹ к месту синтеза РНК, необходимая для перемещения энергия выделяется при гидролизе АТР (рис.30.6).
Рис.30.6. Механизм ρ-зависимой терминации транскрипции
При этом ρ-белок наталкивается на образующуюся в РНК «шпильку» и останавливает полимеразу, которая могла бы продолжить транскрипцию. Механизм ρ-независимой терминации изучен хуже, в нем остается много неясного.
Транскрипция у эукариот
РНК-полимеразы эукариот изучены значительно слабее, чем соответствующие ферменты бактерий. Синтез РНК у эукариот осуществляют три различных фермента: РНК-полимеразы I, II и III. Их структура изучена не полностью. РНК-полимераза I необходима для синтеза 18S-, 5,8S- и 28S-рибосомальных рНК; РНК-полимераза II участвует в синтезе мРНК, некоторых мяРНК; РНК-полимераза III необходима для синтеза 5S рРНК, тРНК и некоторых мяРНК. У эукариот ни одна из РНК-полимераз не способна самостоятельно связываться с промоторами транскрибируемых ими генов. Для этого необходимы специфичные для каждой РНК-полимеразы белковые факторы транскрипции (TF-факторы) (рис. 30.7). Механизмы транскрипции у эукариот и прокариот идентичны.
Рис.30.7. Комплекс инициации транскрипции у эукариот
На рис. 30.7 в составе комплекса приведены общие факторы транскрипции (TFIIB, E, F, H и TBP), РНК-полимераза II, медиатор и специфический фактор транскрипции, связанный с энхансером