Коэффициент пересчета азота на белок в биологическом материале
Методы определения белка в биологическом материале основаны на определении содержания общего азота:
ОА = БА + НБА,
где ОА - общий азот; БА - белковый азот; НБА - небелковый азот.
Массовая доля азота to (N) = 16 %, т. е. в 100 г белка содержится 16 г азота. Составляем пропорцию:
100 г Б - 16 г N
хгБ-lrN
х = 6,25,
т. е. в 6,25 г белка содержится 1 г азота.
Коэффициент пересчета азота на белок в биологическом материале К = 6,25.
Физико-химические свойства белков
1. Для белков характерна большая молекулярная масса (М = 6 • 103—6 • 107). Для определения молекулярной массы используются различные физические методы: гравитационный, гельфильт-рационный, электрофоретический и др.
2. Белки — гидрофильные, т. е. имеющие сродство к воде, соединения. Молекулы воды образуют гидратные оболочки белков.
3. Белки — амфотерные полиэлектролиты, так как содержат -СООН- и -NH2-rpynnbi.
При изменении рН среды происходит подавление диссоциации карбоксильных или аминогрупп, изменяется общий заряд белковой молекулы.
4. Изоэлектрическое состояние белков — электронейтральное состояние, когда суммарный заряд белка равен нулю для конкретного значения реакции среды.
В изоэлектрической точке (ИЭТ) белок является наименее устойчивым. Электронейтральные молекулы легко сближаются, склеиваются, коагулируют, выпадают в осадок.
Значение рН, отвечающее ИЭТ белка, определяется числом ионогенных групп. Если белок содержит больше основных аминокислот, ИЭТ выше 7, при преимущественном содержании кислых аминокислот (моноаминодикарбоновых) — ниже 7. Для большинства глобулярных белков рН 4,5—6,5. *
Для белков со щелочными свойствами ИЭТ наступает при рН 10—12 (рН > 7), для белков с кислотными свойствами — при рН < 7.
Изоэлектрическую точку следует отличать от изоионной точки. Изоионной точкой называется такое значение рН, при котором число протонов, связанных с основными группами, равно числу протонов, отданных диссоциированными кислотными группами в белкой молекуле. Изоионной точке соответствует такое значение рН, при котором суммарный заряд белковой молекулы равен нулю в уао-виях полного отсутствия электролитов в растворе.
Изоэлектрическая и изоионная точки совпадают, когда растер белка не содержит никаких других ионов, кроме ионизированях остатков аминокислот белковой молекулы и ионов, образующий при диссоциации воды.
5. Денатурация белка — нарушение нативной (природной) пространственной структуры белковой молекулы, приводящее к умеь-шению или полной потере ее растворимости, изменению физко-химических свойств белка, утрате биологической активности. Денау-рация — это необратимое осаждение белков, при котором проиео-дит разрушение четвертичной, третичной и вторичной структур (jhc-щепление дисульфидных, гидрофобных, ионных, водородных связи). Первичная структура не разрушается, денатурация не сопровояда-ется разрывом ковалентных связей в составе полипептидной ции.
Денатурирующие факторы подразделяются на физичесие и химические.
К химическим факторам относятся:
— концентрированные минеральные кислоты (H2SO4, HC1, HN03);
— катионы тяжелых металлов, анионы иода и тиоцианата;
— органические растворители (низшие спирты, этиленгликиь, диоксан, диметилсульфоксид);
— трихлоруксусная кислота;
— сульфосалициловая кислота;
— таннин;
— мочевина, формамид, гуанидинхлорид и другие амиды. Максимальное денатурирующее действие мочевина и др]тие
амиды оказывают при высоких концентрациях (6 М — 10 М). Физическими факторами являются:
~ высокая температура;
— высокое давление (5 000-10 000 атм.); ~ энергичное встряхивание;
— облучение звуковыми волнами высокой частоты; ~ ультрафиолетовое излучение;
~ ионизирующее излучение.
При денатурации белков пептидные связи становятся более Доступными для действия протеолитических ферментов, протеолиз денатурированных белков протекает с большей скоростью, чемнативных. Полная денатурация белков (ферментов) в большинстве случаев необратима, однако иногда их удается ренатурировать.
Способность к ренатурации после нагревания характерна для фермента трипсина. Необходимым условием его ренатурации является медленное охлаждение белка до комнатной температуры ("отжиг"), при этом восстанавливается нативная конформация и биологическая функция трипсина.
6. Гидролиз белков — характерное свойство белковых молекул. Конечными продуктами гидролиза являются аминокислоты.
Гидролиз подразделяется:,
— на кислотный;
— щелочной;
— ферментативный.
Ферментативный гидролиз белков протекает с участием протео-литических ферментов.
7. Высаливанием называется осаждение белков из водных растворов под действием высококонцентрированных нейтральных солей (солей щелочных и щелочноземельных металлов). Высаливание — обратимое осаждение при определенных условиях.
Высаливание — это процесс, обратный солевому растворению, т. е. возрастанию растворимости белков в воде при добавлении небольших концентраций нейтральных солей ((NH4)2SO4, Na2SO4, MgSO4 и др.). В результате увеличивается степень диссоциации ионизированных групп белка, происходит экранирование заряженных групп белковых молекул, увеличение диэлектрической постоянной воды.
При высаливании происходит разрушение гидратных оболочек. Относительная эффективность высаливающего действия различных ионов зависит от их размера, величины заряда, способности к гидратации. При больших концентрациях ионов в растворе они притягивают к себе от заряженных групп белка поляризованные молекулы воды и нарушают гидратную оболочку белка, которая предотвращает его осаждение.
По способности к высаливанию белков из водного раствора анионы и катионы образуют лиотропные ряды — ряды Гофмейстера:
— для анионов
SO/" > F- > [Цитрат?- > [Тартрат]2- > СН3СОО" > С1" > Вг > > \~ > CNS" (роданид);
— для катионов
Ва2+> Sr2+ > Са2+ > Mg2+ > Cs+ > Pb+ > К+ > Na+ > Li+.
На практике для высаливания часто используют NaCl, (NH4)2SO4 и MgSO4. Хлорид натрия осаждает белки слабее, чем сульфат аммония, так как обладает меньшей дегидратирующей способностью (в соответствии с положением ионов в ряду Гофмейстера).
8. Водоудерживающая способность белков мышечной ткани. Белково-водный коэффициент.
Белки мышечной ткани обладают высокой влагоудерживающей способностью (БУС), которую определяют как количество клеточного сока, выделенного тканью при механическом воздействии на нее, и выражают в процентах. Например, величина ВУС мяса рыбы колеблется от 10 до 25 %, зависит от вида рыбы, степени свежести и т. д.
Белково-водный коэффициент (БВК) — это отношение содержания белка к содержанию воды.
ВУС и БВК играют важную роль в технологических процессах.
9. Оптические свойства. Белки поглощают ультрафиолетовый свет в трех областях:
— поглощение при длинах волн более 250 нм с максимумом около 280 нм обусловлено присутствием трех циклических аминокислот (триптофана, тирозина, фенилаланина). Основной вклад дают триптофан (Ятах= 278 нм) и тирозин (А,тах= 275 нм);
— поглощение при 210—250 нм имеет сложную природу и определяется присутствием водородных связей, а-спиральных участков, наличием ароматических и других аминокислот;
— поглощение при 190нм обусловлено наличием в белке пептидных связей.
На этом свойстве основан спектрофотометрический метод количественного определения белка (в основном по интенсивности поглощения при 280 нм). При работе с белками условно принимают, что одна единица оптической плотности раствора при 280 нм соответствует концентрации белка 1 мг/см3 при рабочей длине кюветы 1 см. s
Для видимого диапазона спектра 380—760 нм способностью поглощать свет обладают только окрашенные белки — хромопроте-ины (гемоглобины, цитохромы, флавопротеины, "голубой" белок).
В инфракрасной области спектра (760—10 000 нм) свет поглощают все белки. ИК-спектроскопию используют для анализа структуры белка.