Растворы высокомолекулярных соединений
Вещества, молекулярная масса которых выше 10 тыс. дальтон, называются высокомолекулярными (ВМС) или полимерами. К числу важнейших природных ВМС относятся белки и полисахариды растительного и животного происхождения (желатин, альбумин, крахмал, агар-агар), натуральный каучук и др. Растворению полимеров предшествует ихнабухание – проникновение молекул растворителя в среду полимера и связанное с этим увеличение его массы и объема. По мере дальнейшего набухания расстояния между макромолекулами увеличиваются настолько, что они начинают отрываться друг от друга и переходить в растворитель и вконце концов все молекулы полимера в силу диффузии равномерно распределяются по всему объему растворителя, образуя истинный раствор.
Различают неограниченное и ограниченное набухание, В первом случае оно заканчивается растворением полимера. Во втором случае набухание не доходит до растворения и образуется студень (набухание желатина в воде при комнатной температуре). Причина ограниченного набухания – в наличии химических связей между макромолекулами, которые не дают им возможности переходить в растворитель.
Свободная и связанная вода в коллоидных pacтвopax
Молекулы воды электронейтральны. Однако, помещенные во внешнее электрическое поле, они проявляют дипольный характер, ориентируясь при этом соответственно электрическим силовым линиям.
Аналогично этому гидратация гидрофильных коллоидов обусловливается электрическими зарядами высокомолекулярных веществ. Таким образом на поверхности этих молекул образуются оболочки из диполей молекул воды, ориентированных в зависимости от знака заряда ВМС. Те слои диполей воды, которые расположены в непосредственной близости к поверхности макромолекулы, наиболее прочно связаны с ней и наиболее упорядоченно ориентированы. Этот слой образует так называемую связанную воду (или структурированную). Остальная часть воды свободная. Исследования показали, что свойства связанной воды резко отличаются от свойств свободной воды. По степени упорядоченности структуры связанная вода приближается к свойствам твердого тела и имеет бóльшую плотность, чем вода свободная. Гидратная оболочка не обладает растворяющими свойствами, поэтому ВМС растворяются в свободной воде.
Свойства растворов ВМС
Различают две группы коллоидных систем - лиофобные, частицыкоторых не имеют сольватной оболочки, и лиофильные, частицы которых сильно сольватизированы. К лиофильным коллоидам до недавнего времени относили и растворы ВМС. Однако исследования показали, что растворы ВМС – это растворы истинные, хотя и обладающие многими свойствами коллоидных растворов.Раствори ВМС обладают малой диффузионной способностью, не проникают через полунепроницаемые мембраны, pacсеивают лучи света.
Однако растворение биополимеров ведет к образованию истинных растворов, так как между дисперсной фазой (молекулы ВМС) и дисперсионной средой нет поверхности раздела, т.е. системы эти гомогенные и, следовательно, обладают агрегативной устойчивостью. Молекулы белков, как известно, имеют либо спиралевидную (фибриллярные белки), либо глобулярную структуру (глобулярные белки). И та и другая структура несет на своей поверхности заряженные группы (-NH3+ и -СОO–). Общий заряд ВМС зависит от соотношения этих групп в молекуле (табл. ). Состояние, при котором число групп -NH3+ равно числу групп СОО¯ в молекуле белков, называется изоэлектрическим состоянием. Заряд молекулы при этом равен нулю. рН, при котором белок находится в изоэлектрическом состоянии (ИЭС), называется изоэлектрической точкой (ИЭТ).
Изменение ИЭС белка в зависимости от рН
| ← Снижение рН среды | Изоэлектрическое состояние, ИЭТ | Увеличение рН среды → |
| Число групп -NH3+ больше числа групп -СОО¯, т.к. в кислой среде диссоциация кислот снижается (белок заряжается положительно) | Число групп -NH3+ равно числу групп -СОО¯ в молекуле белка (молекула белка электронейтральна) | Число групп -NH3+ меньше числа групп -СОО¯, т.к. степень диссоциации кислот увеличивается (белок заряжается отрицательно) |
Перезарядка групп -NH2 и -COOH при изменении рН среды существенно изменяет вид спирали и глобулы, т.е. меняют конфигурацию белковой молекулы, а это существенно сказывается на функциональной способности молекулы. Введение в раствор сильных электролитов (например, солей) приводит к конкуренции их за молекулы воды у ВМС, а это снижает растворимость их и облегчает процесс нейтрализации заряда полимера. В итоге ВМС выпадает в осадок. Осаждение полимеров солями называетея высаливанием.
По степени высаливающей способности вводных растворах ионы располагают в так называемые лиотропные ряды:
С4Н4О62– >SO42–>CH3COO–>CI–>NO3–CNS–
и Li+>Na+>K+>Rb+>Cs+>Mg2+>Ca2+>Sn2+>Ba2+
Расположение ионов в лиотропных рядах связано не столько с зарядом иона, сколько со степенью его гидратации.
После отмывки полимера от электролита (например, диализом), он снова может быть переведен в растворимое состояние, т.е. процесс высаливания обратим.
Денатурация
Потеря ВМС своих первоначальных свойств (нативных свойств) за счет изменения пространственной структуры полимера называется денатурацией. Это можно наблюдать при нагревании (но не выше 70°) и охлаждении, высаливании, при действии кислот (органических), алкалоидов и т.д. Денатурация может быть обратимой (условия указаны в скобках) и необратимой (при нагревании выше 70о С, при действии сильных минеральных кислот, солей тяжелых металлов, алкалоидов). Этот факт следует, прежде, всего учитывать при работе с растворамибелков.
Студни
Растворы высокомолекулярных соединений (и некоторые коллоидные системы) способны при определенных условиях терять текучесть и застудневать, образуя при этом студни.
В студнях частицы дисперсной фазы связаны между собой в сетчатый каркас, а дисперсионная среда заключена в промежутки между ними. Таким образом, студни – это структурированные системы со свойствами эластичных твердых тел. Студнями являются хлеб, джем, желе, мармелад, кисель, сыр, простокваша и т.д.
Студни делят на две группы:
а) эластичные ( или обратимые), получаемые из ВМС;
б) хрупкие (необратимые), получаемое из неорганиче-
ских гидрофобных золей.
Для студней характерен ряд свойств твердых тел: они сохраняют форму, обладают упругими свойствами иэластичностью. Однако их механические свойства определяются концентрацией и температурой. При нагревании студни переходят в вязкотекучее состояние. Этот процесс называется плавлением. Он обратим, т.е. при охлаждении раствор снова застудневает.
Студни, полученные из растворов ВМС, при высушивании могут уменьшаться в объеме.
Свежеприготовленные студни с течением времени подвергаются изменениям, т.к. процесс структурирования в студне продолжается. При этом на поверхности студня появляются капельки жидкости, которые, сливаясь, образуют жидкую среду. Такой самопроизвольный процесс разделения студня на две фазы, сопровождающийся изменением объема студня, называется синерезисом. Чаще всего процесс этот нежелателен, но при производстве творога, созревания сыра он играет положительную роль.
БЕЛКИ; БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ
Аминокислоты
Биологическая химия – наука о химии жизни, о химических явлениях живой природы. Биологическая химия изучает химический состав живых организмов, химические процессы, обеспечивающие их существование.
Жизнь – это форма движения материи, качественно более высокая, чем физическая и химические формы. Она реализуется в индивидуальных биологических организмах. Все живые организмы содержат органические макромолекулы, построенные по общему принципу. Например, бактериальная клетка – кишечная палочка (E.coli) – содержит 5000 различных органических соединений, в том числе 3000 различных белков. Вместе с тем, для всех живых систем известны общие черты. Например, нуклеиновые кислоты состоят из 4-х нуклеотидов, белки – из 20 различных аминокислот, хотя нет полностью тождественных двух организмов по составу белков и нуклеиновых кислот. Общим является также использование энергии через аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ). Во всех живых организмах химические процессы происходят при определенной температуре (например, 370C), рН и осмотическом давлении в водной среде. Катализаторами биохимических реакций являются ферменты. Все молекулы, клеточные структуры тканей организма в высокой степени упорядочены, взаимозависимы. Каждый организм является саморегулирующейся системой, для которой характерен обмен веществ, рост, размножение. В организме постоянно происходит расход энергии, образующейся за счет веществ, поступающих из внешней среды. Нормальная жизнедеятельность возможна лишь при определенном химическом составе клеток и тканей. Это обеспечивается в результате синтеза необходимых веществ. Субстратом для синтеза являются питательные вещества – белки, углеводы, липиды, витамины, соли, вода, кислород, которые поступают в организм из окружающей среды. В живых клетках расщепление веществ – (диссимиляция) – постоянно сочетается с их синтезом (ассимиляция). Распад и синтез – это две стороны единого процесса жизнедеятельности.
Живая материя представляет собой сложную биологическую систему, где ведущую роль играют белки и нуклеиновые кислоты. В природе нет живых существ без белков и нуклеиновых кислот. Белки занимают центральное место во всех химических процессах, обуславливающих обмен веществ организма. Нуклеиновые кислоты являются хранителем наследственной информации. Углеводы, липиды, неорганические соли и вода играют важную роль, но занимают подчиненное положение. Важной особенностью обмена в животной клетке является единство и взаимосвязь происходящих в ней многочисленных реакций.
В зависимости от объекта изучения различают биохимию человека, животных, растений, микробов, вирусов. По направлению изучения биохимию делят на статическую, где изучается химический состав, свойства исследуемого объекта; динамическую, изучающую превращение веществ с момента поступления в организм и заканчивая выделением конечных продуктов обмена и функциональную, где изучаются химические основы физиологической деятельности организма в целом, органа, ткани, клетки. Общая биохимия рассматривает общие для всех живых систем закономерности, частная биохимия рассматривает биохимические особенности отдельных систем, органов, тканей и клеток.
Живой организм характеризуется высокой степенью упорядоченности составляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей многообразие биологических функций. В этом структурно-функциональном единстве организмов, составляющем сущность жизни, белки играют важнейшую роль.
Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название протеины (от греч. protos – первый, важнейший) – точно отражает первостепенное биологическое значение белков. В отечественной литературе слово «белки» принято называть по аналогии с белком куриного яйца, приобретающем при кипячении (денатурации) белый цвет.
Сейчас, когда достоверно установлено, что наследственная информация у любых живых организмов сосредоточена в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), не вызывает сомнения то, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых реализуется эта генетическая информация. Без белков, в частности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может самовоспроизводить себя – свойства, необходимые для наследственной передачи генетической информации.
Основные проявления жизни: пищеварение, раздражимость, сократимость, способность к росту и размножению, движение, обмен веществ – все связаны с веществами белковой природы. Белки являются основой структуры и функции живых организмов, они выполняют чрезвычайно многообразные функции; считают, что в природе существует 1010 - 1012 различных белков, обеспечивающих существование 1,2 • 106 видов живых организмов различной сложности организации. В клетке E.coli содержится около 3000 различных белков, а в организме животных их насчитывается около 100000. Из этого огромного количества разнообразных белков сейчас известно строение более 3000. Самое удивительное заключается в том, что такое большое разнообразие белковых молекул построено из сравнительно простых блоков (кирпичиков) – аминокислот. В состав природных белков входит всего около 20 видов аминокислот.
Белки в организме выполняют следующие основные функции:
1. Каталитическая функция белков. Все пор открытые биологические катализаторы – ферменты являются белками, известных ферментов сейчас свыше 3000. Эта функция белков является уникальной, не свойственной другим полимерным молекулам. Правда, в последнее время стало известно, что рибонуклеиновые кислоты также могут обладать ферментативной активностью. Их называют рибозимами.
2. Питательная (резервная) функция белков. К таким белкам относятся так называемые резервные белки, являющиеся источником питания для развития плода; белки яйца (овальбумины) и основной белок молока (казеин), также выполняют главным образом питательную функцию. Ряд белков используется в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ.
3. Транспортная функция белков. Дыхательная функция крови, в частности, перенос O2, целиком осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Белки сыворотки образуют комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы.
4. Защитная функция белков. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунологическая система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков – антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов или вирусов. Взаимодействие антител с антигенами (чужеродными белками) способствует нейтрализации их биологического действия, что обеспечивает безопасность организма от генетически чужеродной информации. Способ свертывания крови это тоже защитная реакция: свертывание белка плазмы крови фибриногена приводит к образованию сгустка крови, что предохраняет от потери крови при ранениях. Интерферон – универсальный противовирусный белок также выполняет защитную функцию.
5. Сократительная функция белков. В сокращении и расслаблении мышц участвуют белки актин и миозин – специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам ряда субклеточных структур, что обеспечивает определенные процессы жизнедеятельности клеток.
6. Структурная функция белков. Структурная функция белков занимает очень большое место. Например: коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, роговой ткани, эластин в сосудистой стенке выполняют пластические и опорные функции. Важную роль играют белки в комплексе с углеводами в формировании ряда секретов – мукоидов, муцинов и т.д. В комплексе с липидами (фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клетки.
7. Гормональная функция белков. В регуляции обмена веществ в организме важную роль играют гормоны, которые вырабатываются в железах внутренней секреции. Ряд гормонов являются белками или полипептидами: гормоны гипофиза – соматотропин, окситоцин, вазопрессин; гормон поджелудочной железы – инсулин и т.д.
Кроме указанных функций, следует отметить, что белки в организме играют важную роль в поддержании онкотического давления и в создании буферных систем. Белки осуществляютгенерирование и передачу нервных импульсов. Например, родопсин является фоторецепторным белком клеток палочек сетчатки глаза, имеются белки – вкусовые рецепторы, обонятельные рецепторы. Молекулы рецепторы приводятся в действие специфическими веществами. Например, рецептор ацетилхолина - белок, состоящий из 5 единиц, образует ионный канал.
Регуляция роста и дифференцировки клеток осуществляется также специальными белками. Имеются белки-репрессоры, интерлейкины, белки (пептиды), регулирующие дифференцировку клетки. Обобщая, следует подчеркнуть, что белки в организме выполняют разнообразные функции, обеспечивающие жизненные процессы. Важно то, что белки обладают высокой специфичностью; например, фермент строго взаимодействует со своим субстратом, антитела с антигеном. Высокой специфичностью наделены также белки, обеспечивающие такие процессы как рост, деление и дифференцировка клеток, онтогенетическое развитие живых организмов, биологическая индивидуальность.
Содержание белков в организме и тканях
Белковыми веществами наиболее богаты органы и ткани животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. Большинство этих белков хорошо растворимы в воде. Однако некоторые органические вещества, выделенные из хрящей, волос, рогов, костной ткани, не растворимые в воде, также отнесены к белкам, т.к. по химическому составу они близки к белкам, выделенным из мышечной ткани, сыворотки крови и т.д.
Важным признаком белков служит наличие в них азота, который входит в состав белка как элемент аминокислот. В белках содержится (в % на сухую массу):
| углерода | 49-55 |
| кислорода | 21-23 |
| азота | 15-17 |
| водорода | 6-8 |
| серы | 0,2-3 |
| фосфора | 1 - 2 |
В состав некоторых сложных белков входят Fe, Cu, J, Zn, Br, Mn и другие элементы. Некоторые из них содержатся в очень малых количествах, но имеют важное жизненное значение. Так, железо в составе белков гемоглобина, миоглобина и цитохромов играет важную роль в процессе дыхания, медь – в окислительных процессах, йод входит в состав гормонального белка щитовидной железы, кобальт – в состав витамина В12, являющегося составной частью ряда ферментов и т.д. Количество азота в белках животного происхождения составляет в среднем 16%или на 1 г азота приходится 6,25 г белка (100:16 = 6,25) Эта величина используется для вычисления содержания белка в различных тканях животных (метод Къельдаля).
В организме животных содержится до 50% белков от сухой массы, в семенах злаков – 8-12, в семенах бобовых – 25-35, в клубнях (картофель) – 0,5-2%.
Таблица 2.1
Содержание белка в некоторых тканях (по Чечеткину А.В.)
| Ткань (орган) | % от массы свежей ткани | % от массы сухой ткани |
| Головной мозг | 7-9 | |
| Легкие | 14-15 | |
| Сердечная мышца | 16-18 | |
| Печень | 18-20 | |
| Селезенка | 19-21 | |
| Скелетная мышца | 18-23 | |
| Ячмень | 11-13 | |
| Кукуруза | 8-10 | |
| Овес | 8-11 | |
| Рожь | 10-12 | |
| Пшеница | 14-16 | |
| Горох | 20-25 | |
| Жмых подсолнечниковый | 32-42 |
Белковые вещества в природе находятся в различных состояниях. Например, белки молока, сыворотки крови представляют коллоидные растворы (золи), другие – твердые вещества, нерастворимые в воде (кератин шерсти, рога и т.д.). В некоторых органах белки находятся в полужидком состоянии (кожа, мышцы).
Методы выделения белков
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, химического состава и строения необходимым условием является получение индивидуальных белков в высокоочищенном, гомогенном виде. Для этого обычно биологический материал измельчают (гомогенизируют), белки извлекают (экстрагируют), разделяют (фракционируют).
Гомогенизация. Существуют различные измельчители гомогенизаторы (ножевые, пестиковые), шаровые мельницы; методы замораживания и оттаивания (попеременное) – для получения вирусных белков; разрушение ультразвуком, пресс-методы (пропускание замороженного материала через мелкие отверстия под давлением) и т.д.
Экстракция белков. Для экстракции белков применяются различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, неионные детергенты – вещества, нарушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.
Широко используются глицерин, растворы сахарозы, буферные смеси – фосфатные, цитратные, боратные со значениями рН от слабощелочных до кислых, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Широко применяется трис-буфер (например, 0,2 M раствор трис (оксиметил) аминометана с 0,1 M раствором HCl в разных соотношениях). Для выделения белков сыворотки крови применяют методы осаждения этиловым спиртом (получение гамма-глобулина), ацетоном, бутиловым спиртом и т.д.
Широко применяется осаждение сульфатом аммония (NH4)2SО4 – для выделения альбуминов и глобулинов.
Для разрыва белково-липидных связей применяют различные детергенты (для отделения от мембран) – тритон Х-100. додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и т.д.