Зміст заняття і хід заняття.
Робота 1. Виготовлення убитої вакцини.
Принцип методу.Для одержання інактивованої вакцини проводять відбір вірулентних штамів бактерій або вірусів, які володіють повним набором необхідних антигенів, інактивують їх, зберігши при цьому антигенну структуру збудника.
Хід роботи: Відібрана для виготовлення вакцини культура посіяна газоном на скошений агар і поставлена на 18-24 години в термостат при 37°С. Перевірити чистоту культури, для чого оглянути характер росту культури, звернувши увагу на його однорідність і відсутність забруднення сторонніми мікроорганізмами. Виготовити мазок і зафарбувати за методом Грама. У препараті повинні бути бактерії одного виду (стафілококи). Приготувати завісину бактерій, для чого стерильною піпеткою внести 3-5 мл стерильного фізіологічного розчину в пробірку з культурою. Посів змити, обертаючи пробірку між долонями, після чого завісину відсмоктати в стерильну пробірку, дотримуючись правил роботи з бактеріальними культурами. Маточну завісину знешкодити при 56—60°С на водяному нагрівачі, нагріваючи 0,5-1 годину. Перевірити ефективність знешкодження шляхом посіву на МПБ і
МПА. Посіви витримують у термостаті 5 діб. Визначити оптичну кількість клітин у завісині за мутністю, для чого в стерильну пробірку, підібрану за стандартом, налити 1 мл маточної завісини і додавати фізрозчин до тих пір, поки мутність у досліді не буде відповідати стандарту. Відмітити використану кількість фізрозчину. Ступінь каламутності порівняти на фоні друкованого шрифту (10 одиниць мутності відповідає 1 млрд. мікробних тіл у 1 мл). Приклад: до 1 мл маточної завісини додано 3,5 мл фізрозчину каламутність дорівнювала 10 од. Отже, в 1 мл маточної завісини міститься 1 + 3,5 млрд. мікробних тіл.
Розрахувати, скільки вакцини густотою 0,5 млрд. можна приготувати із маточної завісини, яка залишилася і відповідно додати фізрозчин. Розрахувати кількість консерванту (карболової кислоти) із розрахунку 0,25%. Розлити вакцину в стерильні ампули по 1 мл і запаяти. Перевірити стерильність розлитої вакцини, для чого вміст однієї ампули з кожних 100 штук (однієї серії) засіяти в об'ємі 0,5 мл на МПБ і МПА і витримати у термостаті 5 діб. Посіви повинні бути стерильними. Перевірити нешкідливість вакцини, для чого вміст ампули ввести білим мишам дочеревно. Миші не повинні загинути. Перевірити імуногенність (ефективність) на лабораторних тваринах. Описати методику, оформити скерування на контроль, згідно інструкції.
Практичне значення.Оволодіння цією методикою дозволяє засвоїти принцип одержання убитої вакцини, а також перевірки контролю її ефективності.
Робота 2. Порівняльна характеристика вакцинних препаратів.
Принцип методу.Тип та метод одержання вакцини ґрунтується на біологічних властивостях збудника. Пріоритетними є методи, які максимально дозволяють розділити вірулентні та антигенні властивості мікроорганізму.
Хід роботи: Проаналізувати інструкції до вакцинних препаратів, ознайомитися з інформацією на етикетках: найменування виробника вакцини, дату виготовлення, термін придатності, № серії, № держконтролю. Звернути увагу на показники непридатності препаратів: пошкодження цілісності ампул, прилипання сухих вакцин до стінок ампул та ін.
Практичне значення.Детальне ознайомлення з вакцинними препаратами необхідне майбутнім лікарям для моделювання потенційної ситуації вибору їх із метою прогнозування схеми проведення профілактичних щеплень.
Робота 3.Одержання імунної сироватки.
Принцип методу.Для отримання імунної сироватки проводять імунізацію тварин за Е.Берінгом.
Хід роботи: Скласти схему одержання імунної сироватки на прикладі імунізації кролика дифтерійним анатоксином. Перелічити можливі методи очищення імунної сироватки.
У кролика, імунізованого дифтерійним анатоксином за схемою, забрати 10 мл крові із серця в стерильну пробірку і поставити на 1 годину у термостат, після того на 0,5-1 годину в холодильник. Відсмоктати сироватку, яка відокремилась від згустку і перелити в стерильну пробірку.
Практичне значення.Методика отримання сироватки з використанням тварин дозволяє оцінити її властивості: гетерогенність, нейтралізуючі властивості тощо.
Робота 4. Визначення активності імунної сироватки. Постановка та облік реакції флокуляції з метою визначення титру антитіл в імунній сироватці.
Принцип методу.Титр антитіл в імунній сироватці визначається за допомогою реакції флокуляції (реакції антиген-антитіло), позитивний результат якої візуально реєструється при появі пластівців.
Хід роботи: Визначити антитоксичний титр сироватки, для чого розлити в 6 пробірок протидифтерійну сироватку в кількостях, які зменшуються: від 0,5 до 0,05 мл і відповідну кількість фізрозчину до 1 мл. До пробірок долити по 1 мл дифтерійного анатоксину з активністю по 10 LF (МО). Змішати похитуванням штатива і поставити на водяний нагрівач при 45°С. Виймаючи пробірки, час від часу розглядати їх. Відмітити пробірку, в якій спостерігається ініціальна флокуляція (випадання пластівців). У цій пробірці кількість антитіл і анатоксину є однаковою. Визначити титр сироватки в антитоксичних одиницях в 1 мл. Приклад: флокуляція відмічена в пробірці з 0,2 мл сироватки, тобто в 0,2 мл сироватки міститься 10 АО і вони зв'язалися з 10 МО анатоксину. Отже, в 1 мл сироватки міститься 5х10 = 50 АО.
Практичне значення.Використання реакції ініціальної флокуляції дозволяє проводити контроль якості імунних сироваток.
Робота 5. Порівняльна характеристика сироваткових препаратів.
Принцип методу.Тип та спосіб одержання препарату імунної сироватки залежить від мети його застосування.
Хід роботи: Вивчення готових заводських препаратів імунних сироваток: лікувальних, профілактичних, діагностичних. Вивчити інформацію на етикетці: виробник, назву сироватки, дату виготовлення, термін зберігання, № держконтролю, одиниці вимірювання. Описати колір, консистенцію. Вивчити інструкцію до препарату, звернути увагу на форму затвердження, спосіб вживання, наявність ознак, що вказують на непридатність препарату до використання. Результати занести в таблицю характеристики препарату.
Практичне значення.Детальне ознайомлення з сироватковими препаратами необхідне майбутнім лікарям для моделювання потенційної ситуації вибору їх із лікувальною, профілактичною чи діагностичною метою.
Робота 6.Одержання моноклональних антитіл.
Принцип методу.Гібридомна технологія Г.Келера та С.Мілштейна дозволяє in vitro отримувати строго специфічні, абсолютно ідентичні за структурою гіперваріабельних ділянок (активних центрів) антитіла.
Хід роботи: Описати етапи одержання моноклональних антитіл, скласти схему, вказати призначення.
Практичне значення.Імунні препарати на основі моноклональних антитіл широко використовуються з діагностичною метою, для постановки імунологічного діагнозу. Для лікування та профілактики інфекційних захворювань препарати, отримані гібридомною технологією, повинні бути пріоритетними, оскільки, на відміну від гетерологічних сироваткових препаратів, не дають побічних реакцій, таких як анафілактичний шок та сироваткова хвороба.
Складання протоколів. Описати хід і етапи виготовлення вакцини (робота 1). Скласти схему отримання імунної сироватки ( робота 3) визначити її активність (робота 4). Скласти таблицю порівняння характеристик вакцинних та сироваткових препаратів та занести в протокол основні дані етикеток бакпрепаратів, вакцин, сироваток (роботи 2 і 5). Скласти схему отримання моноклональних антитіл (робота 6).
Література.
1. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. -М., 2005.-С.217 – 222.
2. Данилейченко В.В., Федечко Й.М., Корнійчук О.П. Мікробіологія з основами імунології. – Медицина, 2009. - С.185 - 186.
3. Застосування швидких тестів у діагностиці інфекційних хвороб. Методичні вказівки (під ред. В.П.Широбокова)
4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. - С.-П., 2002. - С. 224 - 227.
5. Климнюк С.І., Ситник І.О., Творко М.С., Широбоков В.П. Практична мікробіологія. – Тернопіль., “Укрмедкнига”. – 2004. – С. 145 - 149.
6. Медична мікробіологія, вірусологія та імунологія (під ред. акад. Широбокова В.П.). – Вінниця., “Нова книга”. – 2011. С.288 – 293, 399.
7. Методичний посібник до практичних занять з імунології та алергології (під.ред. проф. Данилейченка В.В.).- Львів, 2000. - С.21-25, 50, 61.
8. Черношей Д.А., Канашкова Т.А. Методы иммуноанализа, основанные на применении меченых компонентов. – Минск, 207 с.
ПЕРЕЛІК
практичних навиків до підсумкового модульного контролю.
1. Провести мікроскопію препарату з використанням імерсійного об’єкту, зробити висновок про морфологічні властивості досліджуваних мікроорганізмів.
2. Приготувати бактеріальний препарат, зафарбувати за методом Грама, здійснити мікроскопію з використанням імерсійного об’єктиву, зробити висновок про чистоту досліджуваної культури мікроорганізмів, її морфо-тинкторіальні властивості.
3. Здійснити посів завісини бактерій на пластинку МПА з метою виділення чистої культури мікроорганізмів. Обгрунтувати наступний хід досліджень.
4. Описати культуральні властивості колоній мікроорганізмів, які виросли на поверхні МПА. Провести оцінку чистоти виділеної культури.
5. Пояснити суть використання диференційно-діагностичних середовищ для вивчення гліколітичних та протеолітичних властивостей мікроорганізмів.
6. Здійснити облік біохімічних властивостей виділеної культури бактерій, провести її ідентифікацію.
7. Обгрунтувати суть вакцинопрофілактики. Підібрати 2-3 живі вакцини, пояснити принцип їх виготовлення і використання.
8. Підібрати 2-3 убиті вакцини, пояснити принцип їх виготовлення і використання.
9. Пояснити суть антитоксичного імунітету. Підібрати препарати для створення активного антитоксичного імунітету.
10. Підібрати препарати для створення пасивного антитоксичного імунітету.
11. Підібрати препарати, які використовують для специфічної профілактики і терапії дифтерії, пояснити аспекти їх використання.
12. Пояснити суть імуноферментного методу досліджень. Здійснити облік ІФА, поставленого з метою серологічної діагностики ВІЛ-інфекції.
13. Пояснити суть серологічної ідентифікації мікроорганізмів. Підібрати препарати, які використовуються з цією метою. Принципи їх одержання.
14. Пояснити суть серологічної діагностики інфекційних захворювань.Підібрати препарати, які використовуються з цією метою, їх одержання.
ПЕРЕЛІК