ЭКСПРЕССИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ.

Лекция № 5

Тема: Репликация ДНК. Экспрессия генетической информации.

План

1. Полуконсерватиный механизм репликации ДНК

2. Биосинтез белка в клетке. Транскрипция. Трансляция.

3. Интрон-экзонная организация наследственного материала у эукариот.

4. Особенности синтеза и-РНК у эукариот: первичный транскрипт, явления процессинга и сплайсинга.

 

Полуконсервативный механизм репликации ДНК. Перед каждым делением клетки в ней должно удвоиться содержание ДНК, чтобы каждая дочерняя клетка получила полный набор хромосом. Основу каждой хромосомы образует одна двухцепочечная молекула ДНК. Предложенная Дж. Уотсоном и Ф. Криком модель строения ДНК форме регулярной двойной спирали сразу же позволила понять принцип копирования ДНК. Ее репликация происходит полуконсервативным способом: две исходные цепи материнской ДНК расходятся, и каждая из них становится матрицей для синтеза новой комплементарной цепи. Таким образом, каждая новая двойная спираль ДНК содержит одну старую и одну новую цепь. Такой механизм репликации ДНК, при котором от одного поколения к другому передается одна из двух материнский цепей ДНК, получил название полуконсервативного и был экспериментально доказан в 1958 году М. Мезельсон и Ф. Сталь.

Легко представить, что удвоение ДНК происходит вследствие того, что цепи расходятся и каждая цепь служит матрицей для синтеза новой комплементарной цепи ДНК. Каждая дочерняя молекула состоит из одной старой материнской и одной новой синтезированной цепи ДНК.
Общие принципы репликации ДНК.

В основе процесса репликации лежит принцип копирования материнской цепи ДНК с образованием двух идентичных молекул ДНК. В основе синтеза новой цепи ДНК лежит принцип комплементарности азотистых оснований, т.е. последовательность нуклеотидов материнской цепи определяет последовательность нуклеотидов в синтезируемой цепи ДНК

Синтез новых цепей ДНК идет в направлении 5’ 3’.

В основе репликации ДНК лежат принципы антипараллельности и униполярности. Синтез новых цепей ДНК идет в направлении от 5’-конца к 3’ - концу, при этом ДНК-полимеразы – ферменты, синтезирующие новые цепи ДНК, - добавляют нуклеотиды к 3’- концу наращиваемой цепи ДНК. При этом матричная цепь имеет противоположную ориентацию: 3’ 5’, т.е. ДНК-полимеразы могут передвигаться вдоль матрицы только в направлении от 3’ к 5’-концам.

Реакция синтеза полинуклеотидной цепи ДНК.
Механизмы синтеза ДНК хорошо изучены в клетках бактерий, однако имеются доказательства, что в клетках эукариот процесс протекает аналогичным образом.
Инициация репликации ДНК. Репликация начинается в специфическом участке молекулы ДНК, который называется точка начала репликации или ориджин.
Точка начала репликации (origin) – это участок молекулы ДНК со специфической последовательностью нуклеотидов с большим содержанием пар АТ (последовательность 300 п.н., богата АТ). Специальные инициирующие белки необходимы для связывания ферментов репликации с молекулой ДНК: белок DnaA – для прокариот белок RPA (replication protein A) – для эукриот.

Кольцевая хромосома прокариот имеет одну точку начала репликации, которая

называется OriC. В этой точке цепи расходятся и образуются две репликативные вилки, которые движутся в противоположном направлении. Скорость синтеза ДНК в клетках прокариот составляет 500 нукл./сек. Две вилки встречаются на противоположной стороне кольца. В клетках прокариот существует специальный фермент гираза (топоизомераза II), который разделяет две образующиеся кольцевые молекулы ДНК. Антибиотик налидиксовая кислота угнетает размножение бактерий, путем инактивации гиразы.

В клетках эукариот этот фермент отсутствует, поэтому налидиксовую кислоту используют в клинической практике для лечения бактериальных инфекций.

Репликация ДНК эукариот начинается одновременно во многих точках начала репликации, от каждой точки движутся две репликативные вилки в противоположных направлениях. Скорость синтеза молекул ДНК эукариот составляет 50 нукл./сек.

Репликон – фрагмент молекулы ДНК, репликация которого происходит под контролем одной точки начала репликации. Кольцевая хромосома прокариот имеет 1 репликон. Геномы эукариот содержат сотни и тысячи репликонов.
Инициация - образование репликативной вилки. Нити ДНК разделяются благодаря действию специальных ферментов и белков.
Хеликаза (от англ. helix – спираль) - основной фермент, расплетающий цепи ДНК. У прокариот он называется белок DnaB. Хеликаза разрывает водородные связи между комплементарными основаниями, используя энергию АТФ.
Топоизомеразы – ферменты, которые устраняют положительные сверхвитки перед репликативной вилкой. Эти ферменты временно разрывают нити материнской ДНК в двойной спирали перед репликативной вилкой, после завершения процесса нити ДНК восстанавливают целостность.
SSB - белки – это белки, которые связываются с одноцепочечной ДНК и удерживают матрицу. В результате образуется репликативная вилка, где и происходит синтез новых цепей ДНК.
Механизм действия ДНК-полимераз. Ферменты, катализирующие процесс синтеза новых цепей ДНК называются ДНК-зависисмые ДНК-полимеразы. В клетках бактерий существует три типа ДНК-полимераз: ДНК-полимераза I, II, III.
Синтез ДНК в репликативной вилке катализирует ДНК-полимераза III. ДНК-полимераза I играет важную роль в синтезе отстающей цепи и репарации ДНК. ДНК-полимераза II участвует в репарации ДНК.
Реакция синтеза. ДНК-полимеразы могут только удлинять (элонгировать) уже существующую полинуклеотидную нить, которую называют затравкой или праймером. В клетках роль затравки играет олигонуклеотид РНК (РНК-праймер), который комплементарен матрице и образует с ней двухспиральныйкомплекс матрица-затравка. Синтез РНК праймера осуществляет фермент праймаза. Затем ДНК-полимераза синтезирует цепь ДНК, используя 3’-OH конец праймера. После окончания синтеза ДНК РНК-праймеры удаляются с помощью ферментов – экзонуклеаз.

 

ДНК-полимераза имеет 2 субстрата: Комплекс матрица – затравка и дезоксинуклеозидтрифосфаты (АТФ, ГТФ,ЦТФ и ТТФ). Реакция осуществляется как удлинение цепи с 3’- конца затравки. Необходимы ионы Mg ²⁺ (3’ – OH) конец полинуклеотидной цепи атакует -фосфат дНТФ, образуя фосфодиэфирную связь . Матрица копируется точно на основе принципа комплементарности.

Кроме полимеризующей активности, ДНК-полимеразы обладают корректирующей активностью: они дважды проверяют нуклеотид, который добавляют в растущую цепь ДНК. Корректирующая активность ДНК-полимераз проявляется в способности отщеплять нуклеотид, некомплементарный матрице, и замещать его комплеметарным нуклеотидом.
Асимметричность репликативной вилки. Поскольку ДНК-полимераза наращивает цепь ДНК в направлении 5’ 3’, синтез дочерних цепей идет в противоположном направлении. Одна цепь синтезируется непрерывно (лидирующая), а другая синтезируется прерывисто, в виде фрагментов Оказаки (отстающая). Фрагменты Оказаки – это короткие цепочки ДНК вместе с РНК-праймерами, расположенные на отстающей цепи.
Синтез отстающей цепи. ДНК-полимераза III останавливается перед РНК-праймером предшествующего фрагмента Оказаки. Здесь подключается ДНК-полимераза I, которая удаляет РНК-праймеры предшествующего фрагмента Оказаки и одновременно наращивает 3’-OH – конец растущей цепи ДНК, заполняя образующуюся брешь. Фермент лигаза соединяет два фрагмента Оказаки, используя АТФ. Таким образом, на отстающей цепи также синтезируется непрерывная цепь ДНК.

Функции теломераз.
Проблема недорепликации 3’-концов линейных молекул ДНК заключается в том, что удаление последних РНК-праймеров с 5’-концов обеих цепей дочерней ДНК, приводит к тому, что дочерние цепи оказываются короче материнской на 10-20 нуклеотидов (у организмов разных видов размер РНК-праймеров различен). Проблема недорепликации 3’-концов линейных молекул ДНК эукариот решается с помощью специального фермента – теломеразы.
В случае репликации кольцевых молекул ДНК этой проблемы не существует, т.к. первые РНК-затравки удаляются ДНК-полимеразой I, которая одновременно наращивает 3’-OH – конец растущей цепи ДНК и заполняет образующуюся брешь.

Ограничение числа клеточных делений. Лимит Хейфлика.

Американский ученый Л. Хейфлик в начале 60-х годов 20 века показал, что культивируемые клетки новорожденных детей могут пройти 80-90 делений, в то время как соматические клетки 70-летних людей делятся 20-30 раз. Такое явление ограничения числа клеточных делений называют “лимитом Хейфлика”.

В 1971 г. А.М. Оловников в своей теории маргинотомии (от лат. marginalis – краевой, toma - сечение) предположил, что последовательное укорочение ДНК хромосом во время репликации лежит в основе ограниченного числа делений, которое наблюдается у нормальных соматических клеток, растущих в культуре in vitro. Позже был обнаружен фермент теломераза, активный в стволовых, половых и раковых клетках, которые способны к бесконечному делению.
Функции теломеразы.
Фермент теломераза впервые был обнаружен в 1985 году у равноресничной инфузории Tetrahymena thermophila, а позже – в клетках дрожжей, растений и животных, в том числе в яичниках человека и иммортализованных (бессмертных) линиях раковых клеток HeLa.

Согласно номенклатуре этот фермент называют теломерной терминальной трансферазой. Теломераза выполняет функции ДНК-полимеразы, которая достраивает 3’-концы линейных молекул ДНК короткими повторяющимися последовательностями нуклеотидов (у позвоночных – ТТАГГГ) в отсутствии ДНК матрицы. В качестве матрицы для синтеза цепи ДНК теломераза использует молекулу РНК, которая является составной частью этого фермента.
Механизм действия теломеразы. В результате того, что после каждой репликации дочерние цепи ДНК оказываются короче материнских на размер первого РНК-праймера (10-20 нуклеотидов), образуются выступающие однонитевые 3’-концы материнских цепей. Они узнаются теломеразой, которая последовательно наращивает материнские цепи на сотни повторов ТТАГГГ, используя 3’- конец материнской цепи ДНК в качестве праймера, а входящую в состав фермента молекулу РНК использует в качестве матрицы. Образующиеся длинные однонитевые концы материнской ДНК в свою очередь служат матрицей для синтеза дочерних цепей по традиционному механизму репликации.

 

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ.

Биосинтез белков в клетках представляет собой последовательность реакций матричного типа, в ходе которых последовательная передача наследственной информации с одного типа молекул на другой приводит к образованию полипептидов с генетически обусловленной структурой.

Биосинтез белков представляет собой начальный этап реализации, или экспрессии генетической информации. К главным матричным процессам, обеспечивающим биосинтез белков, относятся транскрипция ДНК и трансляция мРНК. Транскрипция ДНК заключается в переписывании информации с ДНК на мРНК (матричную, или информационную РНК). Трансляция мРНК заключается в переносе информации с мРНК на полипептид. Последовательность матричных реакций при биосинтезе белков можно представить в виде схемы.

 

нетранскрибируемая цепь ДНК	А Т Г	Г Г Ц	Т А Т
транскрибируемая цепь ДНК	Т А Ц	Ц Ц Г	А Т А
транскрипция ДНК	ß	ß	ß
кодоны мРНК	А У Г	Г Г Ц	У А У
трансляция мРНК	ß	ß	ß
антикодоны тРНК	У А Ц	Ц Ц Г	А У А
аминокислоты белка	метионин	глицин	тирозин

 

На схеме видно, что генетическая информация о структуре белка хранится в виде последовательности триплетов ДНК. При этом лишь одна из цепей ДНК служит матрицей для транскрипции (такая цепь называется транскрибируемой). Вторая цепь является комплементарной по отношению к транскрибируемой и не участвует в синтезе мРНК.

Молекула мРНК служит матрицей для синтеза полипептида на рибосомах. Триплеты мРНК, кодирующие определенную аминокислоту, называются кодоны. В трансляции принимают участие молекулы тРНК. Каждая молекула тРНК содержит антикодон – распознающий триплет, в котором последовательность нуклеотидов комплементарна по отношению к определенному кодону мРНК. Каждая молекула тРНК способна переносить строго определенную аминокислоту. Соединение тРНК с аминокислотой называется аминоацил–тРНК.

Молекула тРНК по общей конформации напоминает клеверный лист на черешке. «Вершина листа» несет антикодон. Существует 61 тип тРНК с разными антикодонами. К «черешку листа» присоединяется аминокислота (существует 20 аминокислот, участвующих в синтезе полипептида на рибосомах). Каждой молекуле тРНК с определенным антикодоном соответствует строго определенная аминокислота. В то же время, определенной аминокислоте обычно соответствует несколько типов тРНК с разными антикодонами. Аминокислота ковалентно присоединяется к тРНК с помощью ферментов – аминоацил-тРНК-синтетаз. Эта реакция называется аминоацилированием тРНК.

На рибосомах к определенному кодону мРНК с помощью специфического белка присоединяется антикодон соответствующей молекулы аминоацил-тРНК. Такое связывание мРНК и аминоацил-тРНК называется кодонзависимым. На рибосомах аминокислоты соединяются между собой с помощью пептидных связей, а освободившиеся молекулы тРНК уходят на поиски свободных аминокислот.

 

Рассмотрим подробнее основные этапы биосинтеза белков.

1 этап. Транскрипция ДНК. На транскрибируемой цепи ДНК с помощью ДНК-зависимой РНК-полимеразы достраивается комплементарная цепь мРНК. Молекула мРНК является точной копией нетранскрибируемой цепи ДНК с той разницей, что вместо дезоксирибонуклеотидов в ее состав входят рибонуклеотиды, в состав которых вместо тимина входит урацил.

2 этап. Процессинг (созревание) мРНК. Синтезированная молекула мРНК (первичный транскрипт) подвергается дополнительным превращениям. В большинстве случаев исходная молекула мРНК разрезается на отдельные фрагменты. Одни фрагменты – интроны – расщепляются до нуклеотидов, а другие – экзоны – сшиваются в зрелую мРНК. Процесс соединения экзонов «без узелков» называется сплайсинг.

Сплайсинг характерен для эукариот и архебактерий, но иногда встречается и у прокариот. Существует несколько видов сплайсинга. Сущность альтернативного сплайсинга заключается в том, что одни и те же участки исходной мРНК могут быть и интронами, и экзонами. Тогда одному и тому же участку ДНК соответствует несколько типов зрелой мРНК и, соответственно, несколько разных форм одного и того же белка. Сущность транс–сплайсинга заключается в соединение экзонов, кодируемых разными генами (иногда даже из разных хромосом), в одну зрелую молекулу мРНК.

3 этап. Трансляция мРНК. Трансляция (как и все матричные процессы) включает три стадии: инициацию (начало), элонгацию (продолжение) и терминацию (окончание).

Инициация. Сущность инициации заключается в образовании пептидной связи между двумя первыми аминокислотами полипептида.

Первоначально образуется инициирующий комплекс, в состав которого входят: малая субъединица рибосомы, специфические белки (факторы инициации) и специальная инициаторная метиониновая тРНК с аминокислотой метионином – Мет–тРНК^Мет. Инициирующий комплекс узнает начало мРНК, присоединяется к ней и скользит до точки инициации (начала) биосинтеза белка: в большинстве случаев это стартовый кодон АУГ. Между стартовым кодоном мРНК и антикодоном метиониновой тРНК происходит кодонзависимое связывание с образованием водородных связей. Затем происходит присоединение большой субъединицы рибосомы.

При объединении субъединиц образуется целостная рибосома, которая несет два активных центра (сайта): А–участок (аминоацильный, который служит для присоединения аминоацил-тРНК) и Р–участок (пептидилтрансферазный, который служит для образования пептидной связи между аминокислотами).

Первоначально Мет–тРНК^Мет находится на А–участке, но затем перемещается на Р–участок. На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, который комплементарен кодону мРНК, следующему за кодоном АУГ. В нашем примере это Гли–тРНК^Гли с антикодоном ЦЦГ, который комплементарен кодону ГГЦ. В результате кодонзависимого связывания между кодоном мРНК и антикодоном аминоацил-тРНК образуются водородные связи. Таким образом, на рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Ковалентная связь между первой аминокислотой (метионином) и её тРНК разрывается.

После образования пептидной связи между двумя первыми аминокислотами рибосома сдвигается на один триплет. В результате происходит транслокация (перемещение) инициаторной метиониновой тРНК^Мет за пределы рибосомы. Водородная связь между стартовым кодоном и антикодоном инициаторной тРНК разрывается. В результате свободная тРНК^Мет отщепляется и уходит на поиск своей аминокислоты.

Вторая тРНК вместе с аминокислотой (в нашем примере Гли–тРНК^Гли) в результате транслокации оказывается на Р–участке, а А–участок освобождается.

Элонгация. Сущность элонгации заключается в присоединении последующих аминокислот, то есть в наращивании полипептидной цепи. Рабочий цикл рибосомы в процессе элонгации состоит из трех шагов: кодонзависимого связывания мРНК и аминоацил-тРНК на А–участке, образования пептидной связи между аминокислотой и растущей полипептидной цепью и транслокации с освобождением А–участка.

На освободившийся А–участок поступает аминоацил-тРНК с антикодоном, соответствующим следующему кодону мРНК (в нашем примере это Тир–тРНК^Тир с антикодоном АУА, который комплементарен кодону УАУ).

На рибосоме рядом оказываются две аминокислоты, между которыми образуется пептидная связь. Связь между предыдущей аминокислотой и её тРНК (в нашем примере между глицином и тРНК^Гли) разрывается.

Затем рибосома смещается еще на один триплет, и в результате транслокации тРНК, которая была на Р–участке (в нашем примере тРНК^Гли), оказывается за пределами рибосомы и отщепляется от мРНК. А–участок освобождается, и рабочий цикл рибосомы начинается сначала.

Терминация. Заключается в окончании синтеза полипептидной цепи.

В конце концов, рибосома достигает такого кодона мРНК, которому не соответствует ни одна тРНК (и ни одна аминокислота). Существует три таких нонсенс–кодона: УАА («охра»), УАГ («янтарь»), УГА («опал»). На этих кодонах мРНК рабочий цикл рибосомы прерывается, и наращивание полипептида прекращается. Рибосома под воздействием определенных белков вновь разделяется на субъединицы.

Модификация белков. Как правило, синтезированный полипептид подвергается дальнейшим химическим превращениям. Исходная молекула может разрезаться на отдельные фрагменты; затем одни фрагменты сшиваются, другие гидролизуются до аминокислот. Простые белки могут соединяться с самыми разнообразными веществами, образуя гликопротеины, липопротеины, металлопротеины, хромопротеины и другие сложные белки. Кроме того, аминокислоты уже в составе полипептида могут подвергаться химическим превращениям. Например, аминокислота пролин, входящая в состав белка проколлагена, окисляется до гидроксипролина. В результате из проколлагена образуется коллаген – основной белковый компонент соединительной ткани.

Реакции модификации белков не являются реакциями матричного типа. Такие биохимические реакции называются ступенчатыми.