КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКА

Биуретовый метод

Количественное определение белка в биологических жидкостях является обязательным при постановке диагноза многих заболеваний. Существует несколько методов количественного определения белка: колориметрический, спектрофотометрический и др.

Принцип метода. Одним из колориметрических методов количественного определения белка является биуретовый метод, основанный на биуретовой реакции. В щелочной среде ионы меди образуют с белками комплексы фиолетового цвета. Интенсивность окрашивания в определенных пределах пропорциональна концентрации белка.

Реактивы:

1) биуретовый реактив 3,5 г растворить в 250 мл дистиллированной воды;

2) стандартный раствор с содержанием белка 2,5; 5,0 и 7,5 мг в 1 мл;

Ход работы.

1. В 4 пробирки вносят по 1 мл раствора белка. В первый три пробирки помещают стандартные растворы белка с известной концентрацией. В четвертую пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно определить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют на 20 минут при комнатной температуре для развития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной 1 см, при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр). В качестве контрольного раствора используют биуретовый реактив.

3. Стоят калибровочную кривую, откладывая по оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат – соответствующие значения оптической плотности. Пользуясь этой кривой и зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, определяют в нем содержание белка.

Вывод:____________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Лабораторная работа № 4

Реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми. В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому получаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном растворителе с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям — денатурации.

Реакции осаждения дают возможность:

1) изучить свойства белков;

2) освободить жидкость от присутствия белка;

3) установить наличие белка в биологических жидкостях, например в моче;

4) высаливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей или спиртом выделить отдельные белковые фракции.

Осаждение белков при кипячении

Принцип метода. Для осаждения белка необходимо разрушить его гидратную оболочку и нейтрализовать его заряд. При кипячении происходит денатурация, поэтому разрушается гидратная оболочка. Белок теряет заряд, если рН раствора близок к изоэлектрической точке этого белка.

Реактивы:

1) 1 % раствор яичного белка;

2) 1 % раствор уксусной кислоты;

3) 10 % раствор NaOH;

4) насыщенный раствор NaCI;

Ход работы.

В 5 пробирок вносят по 5 капель 1 % раствора яичного белка.

Затем добавляют:

во вторую пробирку - 1 каплю уксусной кислоты;

в третью - 10 капель уксусной кислоты;

в четвертую - 5 капель уксусной кислоты и 2 капли насыщенного раствора NaCI;

в пятую - 2 капли NaОН.

Все пробирки кипятят 5 минут в водяной бане. Результаты оформляют в виде таблицы

Результат:

№ пробирки	Ход анализа, реакция среды	Наличие осадка (есть или нет)	Произошла ли денатурация (да или нет)	Наличие факторов стабилизации
Гидратная оболочка (есть или нет)	Заряд (если есть заряд, указать его знак)
	Нагреть до кипения, нейтральная
	Нагреть до кипения + слабокислая
	Сильнокислая + нагреть до кипения,
	Кислая +электролит + нагреть до кипения
	Щелочная + нагреть до кипения,

Вывод:______________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

⇐ Назад