Кислотный гидролиз нуклеопротеинов

⇐ Назад

Принцип метода.Нуклеопротеиды – сложные белки, простетической группой которых являются нуклеиновые кислоты. В кислой среде происходит ослабление ионного взаимодействия между белком и нуклеиновыми кислотами и их разделение. При последующем нагревании гидролиз протекает до аминокислот, пуриновых или пиримидиновых оснований, рибозы или дезоксирибозы, фосфорной кислоты.

Реактивы:

1. пекарские дрожжи;

2. 10% раствор H₂SO₄;

3. 10% раствор NaOH;

4. 1% раствор CuSO₄;

5. аммиак концентрированный;

6. 1% раствор нитрата серебра;

7. 1% спиртовой раствор тимола (или нафтола);

8. концентрированная H₂SO₄;

9. 30% раствор NaOH;

10. 7% раствор СuSO_4;

11. молибденовый реактив;

12. 1% раствор дифениламина.

Ход работы: 1 г пекарских дрожжей помещают в круглодонную колбу. Добавляют 20 мл 10% раствора серной кислоты, 20 мл воды и закрывают пробкой с обратным холодильником. Кипятят 40-50 мин. Охлаждают, переливают в цилиндр. Доводят до первоначального объема и фильтруют.

С фильтратом проделывают качественные реакции на составные части нуклеопротеидов:

Проба на пептиды:5 капель гидролизата смешивают с 10 каплями 10% раствора NaOH и 1 каплей 1 % раствора CuSO₄. Содержимое окрашивается в розовый цвет.

Проба на пуриновые основания:к 10 каплям гидролизата добавляют 1 каплю концентрированного аммиака и 5 капель 1 % раствора нитрата серебра. Через 3-5 амин появляется бурый осадок серебряных производных пуриновых оснований.

Проба на пентозы (реакция Молиша):к 10 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли 1% спиртового раствора тимола (или нафтола). Содержимое перемешивают и по стенке приливают 20 капель концентрированной серной кислоты.

При встряхивании образуется красное окрашивание продукта конденсации фурфурола с тимолом, образовавшимся из пентозы.

Проба Троммера на рибозу и дезоксирибозу:к 5 каплям гидролизата добавляют 10 капель 30% раствора NaOH и 1-3 капли 7% раствора СuSO₄ до появления неисчезающей мути Cu(OH)₂ перемешивают. При нагревании до кипения выпадает желтый осадок гидроксида меди (I) или красный осадок оксида меди (I).

Качественная реакция на рибозу и дезоксирибозу с дифениламином: дифениламин дает синее окрашивание с дезоксирибозой и зеленое - с рибозой. К 5 каплям гидролизата добавляют 20 капель 1% раствора дифениламина и пробирку ставят в кипящую водяную баню на 15 минут. Развивается сине-зеленое окрашивание.

Проба на фосфорную кислоту: к 3-5 каплям гидролизата прибавляют 20 капель молибденового реактива (7,5 г молибдена аммония растворяют в 100 мл дистиллированной воды и добавляют 100 мл 32% раствора азотной кислоты с относительной плотностью 1,2) и кипятят несколько минут. Развивается желтое окрашивание. Пробирку сразу охлаждают в струе холодной воды. На дне пробирки появляется кристаллический лимонно-желтый осадок фосфорно-молибденово-кислого аммония.

Результат: ___________________________________________________________________

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________________

V.ТЕМА: БИОЛОГИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

Лабораторная работа № 9

Обнаружение НАД в дрожжах

Принцип метода НАД встречается во многих органах и тканях человека и животных, богаты им и дрожжи. НАД легко извлекается из дрожжей горячей водой (он термостабилен) и может быть обнаружен по образованию флуоресцирующего комплекса с ацетоном. Эта реакция характерна для N-производных амида никотиновой кислоты. Она применяется для определения метилникотинамида в моче.

Реактивы:

дрожжи,
ацетон,
30% раствор NaOH,
спиртовой раствор фенолфталеина.

Ход работы. В пробирку помещают кусочек дрожжей величиной 4—5 мм, добавляют 1/3 пробирки воды и кипятят 20—30с, не допуская выбрасывания жидкости. Отфильтровывают в пустую пробирку 5—10 капель полученного экстракта, добавляют 3—5 капель ацетона и 1—2 капли 30% раствора едкого натра. Оставляют пробирку на 2 мин; затем добавляют 1 каплю 5 г/л спиртового раствора фенолфталеина и по каплям концентрированную соляную кислоту до обесцвечивания фенолфталеина. Пробирку в процессе добавления кислоты встряхивают. Поместить пробирку на 2 мин в кипящую водяную баню, затем охладить и поднести к включенному флюориметру. Ацетоновый комплекс НАД флюоресцирует, синим светом.

Результат: __________________________________________________________________

__________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

Вывод_______________________________________________________________________

Лабораторная работа № 10

⇐ Назад