Реакция на цистеин (реакция Фоля)
Занятие № 1.
«Строение, свойства и функции белков».
Инструктаж по технике безопасности при работе в биохимической лаборатории.
2. Тема занятия: «Строение, функции и свойства белков».
3. Вопросы для контроля:
1) Место биохимии среди других наук.
2) История развития биохимии белков.
3) Пептидная теория строения белков (основные аминокислоты, их классификация, нестандартные аминокислоты, пептидная связь).
4) Первичная структура белков (аминокислотная последовательность, экспериментальное определение последовательности аминокислот).
5) Вторичная структура белков (a-спираль и b-слой; взаимодействия, стабилизирующие вторичную структуру).
6) Третичная структура белков и взаимодействия, стабилизирующие ее.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 1
Тема: «Получение яичного альбумина».
Яичный белок представляет собой 10%-ный водный раствор нескольких белков и, в противоположность желтку, не содержит в заметных количествах других органических соединений, таких как липиды и углеводы. Это заметно упрощает процедуру выделения белков. Почти 70% яичного белка составляет яичный альбумин, который легко отделить от глобулиновой фракции путем 10-кратного разведения яичного белка дистиллированной водой. В этом случае белки глобулиновой фракции выпадают в осадок и их легко отделить от раствора фильтрованием или центрифугированием. Яичный альбумин остается в растворе.
Материал исследования: Белок куриного яйца, 1%-ный раствор желатина.
Реактивы:Дистиллированная вода, 10%-ный и 30%-ный растворы NaОН, азотная
кислота конц., 5%-ный раствор ацетата свинца, 1% р-р CuSO4.
Оборудование: 1. Химические стаканы на 500 и 100 мл
2. Цилиндры на 500 и 250 мл
3. Мерные колбы на 100 мл
4. Воронки
5. Стеклянные палочки
6. Фильтры.
7. Штативы с пробирками, пипетки, спиртовки.
Ход работы.
1. Чтобы отделить белок от желтка, осторожно проделывают отверстие в скорлупе с двух концов и выливают белок в стакан на 500 мл. В тот же стакан приливают 250 мл дистиллированной воды и содержимое тщательно перемешивают стеклянной палочкой.
2. Затем раствор переносят в мерный цилиндр и объем раствора доводят до 300 мл добавлением дистиллированной водой. Раствор оставляют на 30 мин при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов.
3. 15 мл полученной суспензии фильтруют через фильтр. Фильтрат, содержащий яичный альбумин используют для дальнейших работ.
Анализ аминокислотного состава. Цветные реакции на белки.
Реакция на ароматические аминокислоты (реакция нитрования).
При нагревании с крепкой азотной кислотой растворы белка дают желтое окрашивание. Реакция обусловлена наличием в белках ароматических аминокислот (фенилаланина, тирозина, триптофана) и основана на образовании нитропроизводных этих аминокислот.
После подщелачивания раствора NH4OH или NaOH желтое окрашивание переходит в оранжевое окрашивание.
Ход работы.
В одну пробирку наливают 5 капель раствора яичного белка, во вторую - раствора желатина. В пробирки добавляют 3-5 капель конц. азотной кислоты и нагревают. В первой пробирке образуется белый осадок, который при нагревании окрашивается в желтый цвет и постепенно растворяется (происходит гидролиз белка), который придает раствору желтую окраску. Пробирки охлаждают, к ним прибавляют по 10 капель 30%-ного раствора NаОН и наблюдают изменение окраски растворов в следствие образования натриевой соли динитротирозина.
Реакция на цистеин (реакция Фоля).
При добавлении к раствору белка раствора NaОН, ацетата свинца и последующем кипячении раствор начинает темнеть. Реакция обусловлена присутствием в белке цистеиновых и полуцистеиновых остатков, которые при нагревании в присутствии крепкой щелочи разрушаются с образованием сульфида натрия:
СН2-SН СН2ОН
ï ï
СН-NH2 + 2 NaOH ¾¾® СН-NH2 + Na2S + 2 Н2О
ï ï
CООН COOH
цистеин серин
Ацетат свинца реагирует со щелочью с образованием плюмбата натрия:
(СН3СОО)2Рb + 2 NaOH ¾¾® Pb(ONa)2 + 2 CH3COOH
Сульфид натрия при взаимодействии с плюмбитом натрия дает черный осадок сульфида свинца:
Na2S + Pb(ONa)2 + 2 Н2О ¾¾® PbS¯ + 4 NaOH
Ход работы.
В одну пробирку наливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, во вторую - 1%-ный раствор желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 30%-ного раствора NaOH и по 1 капле 5%-ного раствора ацетата свинца. При кипячении жидкость в пробирке с яичным белком темнеет, т. к. образуется черный осадок сульфида свинца. В пробирке с желатином черного осадка не образуется, т.к. желатин серосодержащих аминокислот не содержит.
Биуретовая реакция.
В одну пробирку наливают 5 капель 1%-ного раствора яичного белка, во вторую - 1%-ный раствор желатина. В каждую пробирку добавляют по 5 капель 10%-ного раствора NaOH и по каплям 1%-ного раствора медного купороса. В начале появляется красноватая окраска, которая переходит в красно-фиолетовую и далее в сине-фиолетовую.
Занятие № 2
«Строение, свойства и функции белков»
1. Четвертичная структура белков. Простые и сложные белки. Глобулярные и фибриллярные белки.
2. Физико-химические свойства белков. Денатурация и ренатурация белков.
3. Методы разделения и очистки, их взаимосвязь с физико-химическими свойствами белков.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 2.
“Выделение казеина из молока”.
В молоке содержится специфический белок казеин, содержащий фосфор; 80% всех белков молока приходится на долю казеина. Этот белок обладает кислыми свойствами и находится в молоке в виде растворимой кальциевой соли.
Исследуемый материал:молоко.
Реактивы:1%-ный раствор соляной кислоты, вода дистиллированная, 10%-ный раствор гидроксида натрия, концентрированная фосфорная кислота, молибденовый реактив, 1%-ный раствор сульфата меди.
Оборудование:химические стаканы емкостью 50 мл, мерные цилиндры на 10 мл, стеклянные палочки, воронки, бюретки, бумажные фильтры, штативы с пробирками.
Ход работы:
1. В химический стакан на 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и добавляют 10-15 кап. 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают аккуратно, по каплям, т.к. в избытке кислоты осадок казеина растворяется. Суспензию перемешивают. Через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.
2. Для удаления соляной кислоты в стакан приливают 10 мл дист. воды, перемешивают и оставляют еще на 5 минут. Надосадочную жидкость аккуратно сливают. К осадку еще раз приливают 10 мл дист. воды. С помощью этой процедуры удаляют большую часть соляной кислоты. Осторожно перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют через бумажный фильтр.
3. После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата прибавляют 10%-ный раствор гидроксида натрия и 2 капли 1%-ного раствора сульфата меди. Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива добавляют 5-7 капель гидролизата и кипятят несколько минут в присутствии фосфорной кислоты (5 капель), жидкость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаждении выпадает кристаллический осадок комплексного соединения (NH4)3PO4´12MoO3.
Контрольные вопросы:
1. К какому классу сложных белков относится казеин?
2. Напишите реакцию серина с фосфорной кислотой.
3. Что такое биуретовая реакция?
Занятие № 3
«Ферменты» (часть 1)
1. Классификация ферментов.
2. Механизм действия ферментов. Специфичность действия ферментов.
3. Влияние параметров среды на активность ферментов. Коферменты и кофакторы.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 3.
Тема: “ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ”.
Расщепление крахмала амилазой можно наблюдать, используя реакцию с йодом.
МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: амилаза слюны (наклонив голову, приоткрывают рот, подносят пробирку к нижней губе и собирают слюну).
РЕАКТИВЫ: I2, 1%-ный раствор в KI; крахмал, 1% раствор; дистиллированная вода, фосфатный буфер с разным значением рН (5,4 - 8,0).
ОБОРУДОВАНИЕ: пипетки, пробирки, термостат (400С), водяная баня и баня со льдом, предметные стекла.
ХОД РАБОТЫ.
1. Наливают в четыре пробирки по 0,5 мл раствора крахмала. Еще в четыре пробирки наливают по 0,5 мл разбавленной (1:10) слюны.
2. Берут первую пару пробирок (одна с ферментом, другая с крахмалом) и помещают в баню со льдом. Вторую пару оставляют при комнатной температуре. Третью пару пробирок помещают в термостат (400С), четвертую - в кипящую водяную баню.
3. Через 10 мин. содержимое каждой пары пробирки сливают вместе, тщательно перемешивают и оставляют стоять еще 10 минут в тех же условиях.
4. Из третьей пробирки отбирают 3 капли жидкости и проделывают реакцию с каплей йода на стекле. Если появляется синее окрашивание, растворы оставляют стоять еще 10 мин. и после этого повторяют реакцию с йодом на стекле. Затем добавляют 2 капли раствора йода во все пробирки и наблюдают за появлением окрашивания.
ОФОРМЛЕНИЕ РАБОТЫ: результаты записывают в таблицу; делают выводы о характере влияния температуры на активность амилазы. Сравнивают результаты, полученные с разными образцами слюны.
| № пробирки | Температура инкубации, 0С | Окрашивание с йодом |
Занятие 4
«Ферменты» (часть 2)
1. Зависимость скорости ферментативной реакции. Действие факторов окружающей среды (температура, рН).
2. Коферменты, кофакторы, их роль в ферментативном катализе.
3. Кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен.
4. Регуляция ферментативной активности: ингибирование и активация. Определение параметров ферментативной реакции и вида ингибирования с использованием графической интерпретации уравнения Лайндивера-Берка.
5. Органоспецифичность ферментов. Изоферменты. Антиферменты. Энзимопатия. Применение ферментов в медицине.
ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №4.
Тема: «Влияние рН на активность амилазы слюны».
Оптимум рН для действия амилазы слюны можно определить при взаимодействии ее с крахмалом при различных значениях рН среды. О степени расщепления крахмала можно судить по реакции крахмала с раствором йода в течение времени. При оптимальном значении рН расщепление крахмала произойдет полностью (окраска с йодом отсутствует). По мере удаления от точки оптимального рН в кислую или щелочную зону расщепление крахмала произойдет только частично до стадии декстринов (красно-бурая или фиолетовая окраска) или крахмал вообще расщепляться не будет (синяя окраска).
ХОД РАБОТЫ.
1. Перед началом работы готовят раствор амилазы и определяют ее активность. Для этого смешивают 1 мл раствора крахмала и 0,5 мл разбавленной 1:10 слюны. Через каждые 2 минуты отбирают по 1 капле этой смеси и смешивают ее с каплей раствора йода на предметном стекле. Крахмал должен полностью расщепляться приблизительно за 10 минут (появляется желтая окраска при пробе с йодом). Если расщепление происходит быстрее, слюну надо развести еще в 2, 3 или 4 раза.
2. В восемь пронумерованных пробирок добавляют по 2 мл фосфатного буфера с различным рН (от 5,4 до 8,0).
| № пробы | ||||||||
| рН | 5,5 | 5,9 | 6,2 | 6,6 | 6,8 | 7,1 | 7,3 | 8,0 |
Следует помнить, что при отмеривании разных буферных растворов нельзя пользоваться одной пипеткой. Необходимо использовать каждый раз чистую пипетку (или наливать из бюретки).
3. В каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора крахмала и по 0,5 мл приготовленного раствора слюны ( разбавленного в зависимости от активности амилазы 1:10; 1:20; 1:50) и оставляют стоять в штативе на столе в течение 10 мин.
4. Из каждой пробирки каплю жидкости смешивают с каплей раствора йода на предметном стекле и сравнивают окрашивание в каждой пробирке. Повторяют эту пробу через 1-2 мин. до тех пор, пока проба из пятой пробирки даст с йодом на предметном стекле красно-бурое окрашивание. Через 1-2 мин после этого во все пробирки добавляют по 2-3 капли раствора йода (начинать с первой пробирки). Содержимое пробирок хорошо взбалтывают.
Сравнивая между собой окрашивание во всех пробирках, делают вывод о степени расщепления крахмала, а следовательно, об активности фермента при этом значении рН среды.
Оформление работы: Результаты вносят в таблицу:
| № пробы | ||||||||
| рН | 5,5 | 5,9 | 6,2 | 6,6 | 6,8 | 7,1 | 7,3 | 8,0 |
| окрашивание йодом |
Делают вывод о характере влияния рН на активность амилазы. Отмечают оптимальное рН для действия амилазы.
Занятие 5.