Аскорбиновая кислота легко окисляется в дегидроаскорбиновую кислоту

( см. учебник А.Я. Николаева “Биологическая химия”, стр. 402).

РЕАКТИВЫ: 1%-ный раствор I₂ в KI; порошок аскорбиновой кислоты.

ХОД РАБОТЫ.

К 5-10 каплям 1%-ного раствора I₂ в растворе KI прибавляют небольшое количество аскорбиновой кислоты. Наблюдают обесцвечивание раствора.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 9.

Тема: «КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ВИТАМИНЫ».

1) Реакция восстановления рибофлавина (витамин В2 ).

Рибофлавин обладает окислительно-восстановительными свойствами. Физио-логическая роль витамина В2 выяснилась, когда было установлено, что рибофлавин входит в состав коферментов ФАД и ФМН, являющихся простетической группой ряда ферментов, относящихся к классу оксидоредуктаз.

Реакция обусловлена восстановлением рибофлавина выделяющимся водородом сначала в рибофлавин (промежуточное соединение красного цвета), а затем в бесцветную лейкоформу:

Рибофлавин (окисленная форма Рибофлавин (восстановленная

желтого цвета) форма, бесцветная).

МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ: 0,25%-ный раствор рибофлавина в воде.

РЕАКТИВЫ: цинк металлический в гранулах; HCl (конц.).

ХОД РАБОТЫ.

В пробирку наливают 10 капель взвеси рибофлавина в воде, добавляют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают гранулу металлического цинка. Выделяющийся в ходе реакции водород взаимодействует с рибофлавином: раствор приобретает постепенно розовую окраску, затем обесцвечивается.

Лабораторная работа №10.

“Количественное определение витамина Р в чае”.

Действие витамина Р и витамина С взаимно связано, они участвуют в окислительно-восстановительных процессах. Терапевтическое действие витамина С более эффективно в присутствии витамина Р. У человека повышается проницаемость капилляров.

Рутин – кристаллическое вещество жёлто-оранжевой окраски. Содержится в тех же продуктах, что и витамин С: в чае, фруктах и ягодах – бруснике, клюкве и др. Количественное определение витамина Р проводят в вытяжке из чая.

Принцип метода: рутин способен окисляться перманганатом калия; в качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом калия после того, как окислится весь рутин. Экспериментально установлено, что 1 мл 0,1 н раствора перманганата калия окисляет 6,4 мкг рутина.

Реактивы:

1. Перманганат калия, 0,05 н раствор;

2. Индикатор с индигокармином;

Оборудование:

1. стаканчики или колбочки;

2. Пипетка вместимостью 10 мл;

3. Микробюретка;

Исследуемый материал:

Чай или готовый экстракт.

Ход работы.

К 100 мг чая приливают 50 мл горячей дистиллированной воды и проводят экстракцию в течение 5 минут. 10 мл экстракта чая отмеривают в стаканчик или колбочку, добавляют 10 мл дистилированной воды и 5 капель индигокармина (появляется синее окрашивание). Титруют из микробюретки 0,05 н раствором KMnO₄до появления устойчивой жёлтой окраски.

Определяют процентное содержание рутина в чае. Расчёт производят по следующей формуле:

3,2 ∙ A ∙ V₁∙ 100

X =

V₂∙ P ∙ 1000

Где Х – содержание витамина Р в препарате, %; 3,2 – стандартный коэффициент пересчёта; А – объём 0,05 н раствора перманганата калия, пошедшего на титрование раствора, мл; V₁ – объём, в котором растворена взятая для анализа навеска, мл; 100 – общее количество вещества для расчёта процентного содержания, г; V₂ – объём раствора, взятого для титрования, мл; Р – навеска, мг; 1000 – перевод микрограммов в миллиграммы (Р = 30-50 мг/100 г).

К занятию иметь пакетик чая (2г) на группу!

ВЕСЕННИЙ СЕМЕСТР.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 11.

ОРТОТОЛУИДИНОВЫЙ МЕТОД: ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ.

Глюкоза при нагревании с ортотолуидином в растворе уксусной кислоты дает синезеленое окрашивание, интенсивность которого прямо пропорциональна концентрации глюкозы и определяется на фотоэлектроколориметре:

Орто-толуидин глюкоза

С ортотолуидиновым реактивом реагируют все альдогексозы, но их содержание в крови невелико, поэтому метод позволяет определить практически одну глюкозу.

РЕАКТИВЫ: 1. Трихлоруксусная кислота, 3%-ный раствор.

2. Ортотолуидиновый реактив.

3. Стандартный раствор глюкозы, 1 г/л (100 мг % раствор), готовят ex tempore.

ОБОРУДОВАНИЕ: Центрифуга, центрифужные пробирки, микропипетка вместимостью 0,1 мл, пипетка вместимостью 1 мл, ФЭК, кровь или сыворотка крови.

ХОД РАБОТЫ:

В две пробирки наливают по 0,9 мл (18 капель) 3%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, затем в одну из них вносят 0,1 мл (2 капли) крови, взятой из пальца (или сыворотка крови), а в другую – 0,1 мл (2 капли) стандартного раствора глюкозы. Содержимое пробирок перемешивают и центрифугируют при 3000 оборотах в минуту в течение 10 минут. Для определения берут по 0,5 мл (10 капель) надосадочной жидкости из каждой пробирки, вносят в обычные сухие пробирки, добавляют по 4,5 мл ортотолуидинового реактива и помещают пробирки в кипящую водяную баню на 8 мин. Необходимо следить, чтобы вода в бане непрерывно кипела. Вынимают пробирки и охлаждают их водопроводной водой до комнатной температуры. Затем измеряют на фотоэлектроколориметре оптическую плотность проб в кюветах на 10 мм против воды с красным светофильтром (620 нм); поскольку контроль на реактивы на ФЭК равен нулю, окраска ортотолуидинового реактива не развивается.

РАСЧЕТ:Содержимое глюкозы в опытной пробе рассчитывают по стандартному раствору глюкозы по формуле:

Сст ´ Еоп

Соп = ——————,

Ест

где Соп – концентрация глюкозы в крови в пробе, ммоль/л; Сст – концентрация глюкозы в стандартной пробе,100 мг/100 мл; Еоп – оптическая плотность пробы; Ест – оптическая плотность стандарта глюкозы. Коэффициент пересчета в единицы СИ (ммоль/л) равен 0,0555.

Нормальное содержание глюкозы в сыворотке крови человека, определяемое ортотолуидиновым методом, колеблется в пределах 3,33-4,99 ммоль/л (60-90 мг%).

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 12

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗЫ В МОЧЕ».

Исследуемый материал:моча.

Реактивы:бумага реактивная «Глюкотест».

ХОД РАБОТЫ:

1. Полностью смочить в моче желтую полоску реактивной бумаги.

2. Поместить реактивную бумажку на пластмассовую пластинку и выдержать около 5-10 минут.

3. Сравнить изменившуюся окраску желтой полоски с цветной шкалой.

Примечания:

1. Для исследования использовать свеженабранную мочу, взятую до приема пищи.

2. На точность анализа отрицательно влияет присутствие в моче аскорбиновой кислоты.

3. Не дотрагивайтесь пальцами желтой полоски реактивной бумаги. Беречь от солнечных лучей и влаги!

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 13

Тема: «КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА НАЛИЧИЕ

ФЕНИЛПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ В МОЧЕ».

Накопление фенилпировиноградной кислоты в организме (в крови, в тканях) и наличие фенилпировиноградной кислоты в моче связаны с отсутствием у детей в печени фермента 4-фенилаланингидроксилазы. При этом фенилаланин не гидроксилируется и не превращается в тирозин. Накопление фенилаланина и продуктов его аномального распада, в частности фенилпировиноградной кислоты, в крови и тканях приводит к нарушению нормального развития мозга и появлению тяжелых нарушений психики ребенка. Доказательством данного наследственного заболевания – фенилпировиноградной олигофрении (слабоумия) – служит выявление повышенного содержания фенилаланина в крови (10-40 мг%) и наличие фенилпировиноградной кислоты в моче.

Метод основан на способности енольной формы фенипировиноградной кислоты образовывать с ионами трехвалентного железа комплексное соединение, окрашенное в сине-зеленый цвет.

ИСЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ:Моча.

РЕАКТИВЫ:1) Серная кислота, 5 Н раствор. 2) Хлорид железа (III) FeCl₃, 10%-ный раствор.

ОБОРУДОВАНИЕ:1) Капельницы. 2) Пробирки. 3) Фильтры. 4) Пипетки на 5 мл.

ХОД РАБОТЫ:

К 5 мл свежепрофильтрованной мочи приливают 4 капли 5 Н раствора серной кислоты, перемешивают и добавляют к смеси 4 капли 10%-ного раствора FeCl₃. При наличии в моче фенилпировиноградной кислоты через 30 сек – 1 мин появляется сине-зеленая окраска, исчезающая через 5 – 10 минут.

УКАЗАНИЯ К СОСТАВЛЕНИЮ ОТЧЕТА:

Написать в тетради образование фенилпировиноградной, фенилмолочной, фенилуксусной кислот из фенилаланина.

Записать в тетрадь технику проведения качественной реакции на фенилпировиноградную кислоту.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 14.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА В МОЧЕ.

Белок в нормальной моче находится в следовых количествах, которые не определяются обычными реакциями, применяемыми в клинической лаборатории.

Появление белка в моче носит название протеинурия или часто альбуминурия, поскольку моча содержит в основном сывороточный альбумин и лишь частично сывороточный глобулин. Протеинурия может быть истинной или ложной. При истинной, или почечной, протеинурии белки сыворотки крови попадают в мочу через почки. Случайная, или ложная, протеинурия наблюдается при попадании в мочу слизи, крови, гноя не из почек, а из мочевыводящих путей.

Белок появляется в моче при нефрите (т.е. воспалении сосудистых клубочков почек, когда увеличивается их проницаемость), в случае сердечной декомпенсации, при некоторых формах повышенного кровяного давления и иногда при беременности. Моча, содержащая белок, становится мутной.

Для обнаружения белка в моче применяется реакция осаждения.

Основными реакциями, наиболее часто применяемыми в клинических лабораториях для

осаждения белка являются следующие:

1) проба с кипячением;

2) осаждение концентрированной азотной кислотой;

3) осаждение сульфосалициловой кислотой (самая чувствительная реакция на белок, положи-

тельная в разведении белка 1:50000).

Наряду с качественным определением белка в моче существует и количественное по методу Робертса-Стольникова-Брандберга, имеющее диагностическое и прогностическое значение. Оно дает возможность судить о результатах терапевтического воздействия.

Данный метод количественного определения белка в моче широко применяется в клинике.

Исследуемый материал:

1) Моча, содержащая белок; 2) Нормальная моча.

Реактивы:

1) Уксусная кислота, 1%-ный раствор; 2) Концентрированная азотная кислота с хлоридом натрия.

Оборудование:

1) Штатив с пробирками; 2) Пипетка (2 шт.); 3) Фильтры; 4) Колбочка; 5) Воронки.

ХОД РАБОТЫ:

Все реакции на открытие патологических составных частей мочи проделываются студентами одновременно и с нормальной мочой.

Профильтрованную мочу (20 капель) нагревают до кипения в пробирке. Образовавшийся при этом осадок представляет собой белок или фосфаты. К горячему раствору добавляют по каплям (1-3) 1%-ный раствор уксусной кислоты.

Если осадок зависит от фосфатов, он растворяется при подкислении мочи; если это белок, осадок свертывается и оседает на дно пробирки.

Следует избегать избытка кислоты.

При проведении пробы Геллера с концентрированной азотной кислотой надо работать осторожно.

В пробирку наливают с помощью капельницы приблизительно около 1 мл концентрированной азотной кислоты (насасывать пипеткой кислоту нельзя) и затем осторожно наслаивают примерно равный объем профильтрованной мочи из пипетки по стенке пробирки так, чтобы жидкости не смешивались. Необходимо наслаивать мочу на HNO₃, а не наоборот, так как азотная кислота имеет больший удельный вес.

Указания к составлению отчета:

В случае присутствия белка на границе жидкостей появляется мутное беловатое кольцо осадка белка.

Отметить в тетрадях разницу результатов проведенных реакций с нормальной и патологической мочой. Записать в тетрадях технику качественного определения белка в моче, указать, что такое протеинурия и причины ее возникновения.

Контрольные вопросы:

1. Какой белок является основным белком мочи?

2. На каких свойствах белка основан данный метод его определения?

3. Что такое проба Геллера?

4. О чем свидетельствует увеличение количества белка в моче?

Лабораторная работа №15.

Определение содержания b-липопротеидов низкой плотности.

Большинство липидов находится в крови не в свободном состоянии, а в составе белково-липидных комплексов: хиломикроны, a- липопротеиды и b- липопротеиды. Липопротеиды можно разделить различными методами: электрофореза, тонкослойной хроматографии, ультрацентрифугирования в солевых растворах различной плотности. При ультрацентрифугировании выделяются хиломикроны и липопротеиды разной плотности: высокой (ЛВП - a-липопротеиды), низкой (ЛНП - b-липопротеиды) и очень низкой (ЛОНП - пре-b-липопротеиды) и др.

Печень играет очень важную роль в обмене липопротеидов. Здесь осуществляются их катаболизм, синтез ЛОНП, осуществляющих транспорт триацилглицеролов и холестерола из печени в другие ткани. Нормальным считают содержание в плазме крови: ЛВП - более 40 мг%, ЛНП - менее 180 мг%, ЛОНП - менее 40 мг%.

Фракции липопротеидов отличаются по количеству белка, относительной молекулярной массе липопротеидов и процентному содержанию отдельных липидных компонентов. Так, a-липопротеиды, содержащие большое количество белка (50-60%), имеют и более высокую относительную плотность (1,063-1,21), тогда как b-липопротеиды и пре-b-липопротеиды содержат меньше белка и значительное количество липидов - до 95% от всей относительной молекулярной массы и низкую относительную плотность (1,01-1,063).

Увеличение b-липопротеидов наблюдается при атеросклерозе, механической желтухе, острых гепатитах, хронических заболеваниях печени, диабете, гликогеновой болезни, ксантоматозе и ожирении. Уменьшение b-липопротеидной фракции описано при b₂-плазмоцитоме.

ПРИНЦИП МЕТОДА:

В основу метода положена способность b-липопротеидов (ЛПНП) осаждаться в присутствии хлорида кальция и гепарина; при этом изменяется мутность раствора. По степени помутнения раствора и судят о концентрации b-липопротеидов в сыворотке крови. Считают, что гепарин способен образовывать с b-липопротеидами комплекс, который под действием хлорида кальция выпадает в осадок.

РЕАКТИВЫ, ОБОРУДОВАНИЕ И ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ:

1. Хлорид кальция (CaCl₂) 0,27%-ный раствор (готовят из безводного реактива).

2. Гепарин, 1%-ный раствор (готовят ex tempore) ,1 мл его должен содержать 1000 ЕД (лучше кристаллический).

3. Фотоэлектроколориметр.

4. Микропипетка ёмкостью 0,2 мл.

5. Сыворотка крови.

ХОД РАБОТЫ.

В пробирку вносят 4 мл 0,27%-ного раствора CaCl₂ и 0,4 мл сыворотки крови и перемешивают. Определяют оптическую плотность раствора (Е₁) против 0,27%-ного раствора CaCl₂ по левому барабану в кюветах на 5 мм, при красном светофильтре (630 нм). Раствор из кюветы переливают в пробирку, добавляют микропипеткой 0,08 мл 1%-ного раствора гепарина, перемешивают и точно через 4 мин снова определяют оптическую плотность раствора (Е₂) в тех же условиях:

Х = (Е₂ - Е₁) ´ 1000

Расчет. Вычисляют разность оптической плотности и умножают её на 1000 - коэффициент эмпирический, предложен Ледвиной, так как построение калибровочной кривой сопряжено с рядом трудностей. Ответ выражают в г/л. В норме содержание b-липопротеидов составляет 3 - 4,5 г/л (300 - 450 мг/%). Содержание b-липопротеидов колеблется в зависимости от возраста и пола.

Примечание. Сыворотку крови, содержащую гепарин, для данного анализа использовать нельзя.

Контрольные вопросы:

1. Что такое липопротеиды?

2. Какие функции выполняют липопротеиды?

3. На чем основан метод определения липопротеидов?

4. При каких патологических состояниях наблюдается нарушение нормальной концентрации липопротеидов крови?

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 16.

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ОБЩИХ ЛИПИДОВ

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ».

Для определения липидов сыворотку предварительно гидролизуют концентрированной серной кислотой. Продукты распада липидов образуют с фосфорнованилиновым реактивом окрашенное соединение, интенсивность окраски которого определяют колориметрически.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ:сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ:1) Концентрированная серная кислота. 2) Фосфорнованилиновая смесь (4 части фосфорной кислоты и 1 часть 0,6%-ного раствора ванилина).

ОБОРУДОВАНИЕ:1) Сухие пробирки. 2) Пипетки. 3) Водяная баня. 4) ФЭК. 5) Кюветы с толщиной слоя 0,5 см.

ХОД РАБОТЫ

Для гидролиза 0,1 мл (2 капли) сыворотки смешивают с 5 мл серной кислоты (конц.), перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 10 мин. Одновременно готовят контрольный раствор: в пробирке тщательно смешивают 0,1 мл (2 капли) дистиллированной воды и 5 мл конц. серной кислоты и оставляют стоять при комнатной температуре.

После окончания гидролиза колбу с гидролизатом охлаждают до комнатной температуры, отбирают 0,2 мл (4 капли) и добавляют 3 мл фосфорнованилиновой смеси, тщательно перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 – 15 мин. Таким же образом смешивают с фосфорнованилиновой смесью контрольный раствор. Интенсивность окрашивания измеряют на ФЭК, длина волны 540 нм.

Количественное содержание липидов рассчитывают по формуле:

С липидов = 38,5 ´ (Д пробы – Д контроля)

Результаты заносят в рабочую тетрадь.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 17.

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СИАЛОВЫХ КИСЛОТ В СЫВОРОТКЕ

КРОВИ МЕТОДОМ ГЕССА».

Метод Гесса колориметрический, основан на цветной реакции, получаемой при нагревании сиаловой кислоты (ацетилнейраминовой) с уксусно-сернокислотным реактивом. Интенсивность буровато-розового окрашивания зависит от концентрации сиаловых кислот.

Исследования сиаловых кислот в крови имеет важное диагностическое значение, особенно при ревматизме, туберкулезе и раке легких, злокачественных опухолях костной ткани, когда содержание их увеличивается.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ:Сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ: 1) Трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор. 2) Уксусно-сернокислотный реактив (95 частей ледяной уксусной кислоты и 5 частей концентрированной серной кислоты).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Водяная баня. 2) Фотоэлектроколориметр. 3) Центрифуга, центрифужные пробирки.

ХОД РАБОТЫ.

К 1 мл сыворотке крови в центрифужной пробирке добавляют 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты и встряхивают (при этом образуется осадок). Затем центрифужную пробирку помещают в кипящую водяную баню на 5 минут и охлаждают. Это приводит к освобождению связей N-ацетилнейраминовой кислоты с белковой частью молекулы гликопротеидов. Центрифугируют при 3000 оборотах в минуту 10 минут. После центрифугирования к 0,4 мл (8 капель) надосадочной жидкости добавляют 5 мл уксусно-кислотного реактива и повторно нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут. При этом появляется буровато-розовое окрашивание. После охлаждения колориметрируют в фотоэлектроколориметре в кювете 10 мм с зеленым (540) светофильтром по правому барабану. Полученную величину экстинции умножают на 1000. Результат определения выражают в величинах экстинции. В норме величина её (ФЭК) колеблется от 100 до 195, что соответствует содержанию сиаловых кислот от 50 до 79 мг %. Метод прост и быстр, более специфичен, чем дифениламиновый, но малочувствителен.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №18.

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПЕРЕКИСИ ЛИПИДОВ В ТЕСТЕ С

ТИОБАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТОЙ».

При высокой температуре в кислой среде малоновый диальдегид (МДА) реагирует с 2 тиобарбитуровой кислотой (ТБК), образуя окрашенный триметиновый комплекс, содержащий 1 молекулу МДА и 2 молекулы ТБК, с максимумом поглощения при 535 нм.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: Сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ: 1) Ортофосфорная кислота (1%-ый раствор). 2) 2-тиобарбитуровая кислота (0,6%-ный раствор). 3) Железо сернокислое FeSO₄ • 7 H₂O (1 мкмоль в пробе). 4) Бутиловый спирт (бутанол-1, н-бутиловый спирт).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Пробирки центрифужные. 2) Прибор для отсасывания верхней фазы 1 шт.

ХОД РАБОТЫ.

К 0,3 мл (6 капель) сыворотки приливают 3 мл 1%-ного раствора ортофосфорной кислоты, добавляют 1 мл 0,6%-ного раствора ТБК и 0,1 мл (2 капли) раствора сернокислого железа. Перемешивают. Пробирки закрывают пробкой, ставят в кипящую водяную баню на 1 час.

Затем пробирки охлаждают в холодной воде, добавляют 4 мл бутанола, тщательно перемешивают и центрифугируют 10 минут при 3000 оборотах в минуту. Измеряют оптическую плотность верхней фазы при длине волны 535 нм (Еоп) против бутанола.

Расчет содержания продуктов (МДА), реагирующих с ТБК, проводят по формуле:

Еоп ´ 10⁶ ´ 4 мл

А = —————————————————— = Еоп ´ 85,47 мкмоль/л,

1,56 ´ 10⁵ (л/моль ´ см) ´ 1 см ´ 0,3 мл

где А – содержание МДА в мкмоль/л;

4 мл – объём бутанольной фазы;

0,3 мл – объём сыворотки;

1,56 ´ 10⁵ л/моль ´ см – коэффициент молярной экстинции МДА;

1 см – толщина слоя кюветы;

10⁶ - коэффициент перевода моль в мкмоль.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 19.

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ КАЛЬЦИЯ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ

(МЕТОД МОЙДИНА И ЗАКА)».

Метод основан на способности органических соединений – комплексонов – взаимодействовать с ионами кальция. В качестве комплексона используется трилон Б (ЭДТА). Трилоном Б титруют ионы кальция, предварительно связанные с индикатором – мурексидом. Момент полного связывания кальция с трилоном Б определяется по изменению цвета мурексида (в комплексе с ионами кальция мурексид красно-оранжевого цвета, свободный от кальция мурексид окрашивается в сине-фиолетовый цвет). Комплекс кальция с трилоном Б более прочен, чем комплекс с мурексидом. Зная концентрацию и объем раствора трилона Б, пошедшего на титрование, находят содержание кальция. Нормальное содержание кальция в сыворотке крови 9-11 мг/дл (2,25-2,64 ммоль/л). Состояние гипокальциемии наблюдается при авитаминозе Д (рахите), у беременных, при недостаточной функции паращитовидной железы, заболеваниях почек, при отравлениях фторидами. Гиперкальциемия встречается реже (гиперпаратиреодизм, опухоли, деструктивные процессы в костной ткани, лейкозы).

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ:сыворотка крови.

РЕАКТИВЫ:1) NaOH, 30%-ный раствор. 2) Трилон Б, 0,05 моль/л раствор. 3) Индикатор (смесь мурексида с хлоридом натрия в соотношении 1:100).

ОБОРУДОВАНИЕ: 1) Колбы вместимостью 100 мл. 2) Цилиндры мерные вместимостью 100 мл.

3) Пробирки. 4) Бюретки.

ХОД РАБОТЫ.

Готовят раствор мурексида для всей группы студентов. Для этого в колбу вносят 1 мл раствора NaOH и 100 мл воды, перемешивают. В полученный раствор добавляют смесь мурексида до появления ярко-фиолетовой окраски. Микробюретку заполняют раствором трилона Б. В две широкие пробирки (опытная и контрольная) наливают по 5 мл раствора мурексида. В опытную пробирку вносят по 0,2 мл (4 капли) исследуемой сыворотки крови (раствор становится розовым). Титруют (без промедления!) из микробюретки раствором трилона Б до исчезновения розовой окраски и восстановления фиолетового цвета (сравнить с окраской контроля, титрование лучше делать при дневном освещении).

РАСЧЕТ:Исходя из того, что 1 мл 0,05 моль/л раствора трилона Б эквивалентен 0,06 мг Са, рассчитывают содержание кальция в сыворотке крови (в мг/дл):

Х = В х 0,06 х 100 х 5,

где В – объем трилона Б, пошедший на титрование опытной пробы, мл.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 20.

Тема: «КАЧЕСТВЕННАЯ РЕАКЦИЯ НА АДРЕНАЛИН И ФОЛЛИКУЛИН».

МАТЕРИАЛ ИССЛЕДОВАНИЯ:раствор адреналина (1:1000).

РЕАКТИВЫ: 1) 1%-ный раствор FeCl₃. 2) 10%-ный раствор NaOH. 3) 10%-ный раствор KIO₃.

4)10%-ный раствор уксусной кислоты.

ОБОРУДОВАНИЕ: штатив с пробирками, пипетки.

ХОД РАБОТЫ.

I. РЕАКЦИЯ С FeCl₃. В пробирку вносят 3 капли раствора адреналина и 1 каплю 1% раствора FeCl₃. Появляется изумрудно-зеленое окрашивание, которое затем при прибавлении 1 капли раствора NaOH приобретает вишнево-красный цвет. Реакция обусловлена тем, что пирокатехиновое ядро образует с ионами Fe⁺³ соединения типа фенолятов.

II. РЕАКЦИЯ НА АДРЕНAЛИН. В пробирку вносят 2-3 капли раствора адреналина, 2 капли раствора KIO₃ и 2 капли раствора уксусной кислоты. Перемешивают и слегка нагревают. Жидкость окрашивается в красно-фиолетовый цвет. Окраска обусловлена тем, что при взаимодействии адреналина с диазореактивом образуется азокраситель.

Качественная реакция на фолликулин (эстрон) проводится с H₂SO₄ (конц.) и обусловлена образованием эфирного соединения коричневого цвета.

РЕАКТИВЫ:H₂SO₄ (конц).

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: фолликулин, спиртовой или масленый раствор.

ХОД РАБОТЫ.

РЕАКЦИЯ С H₂SO₄ (конц).

Для спиртового раствора фолликулина.

В пробирку наливают 20-30 капель спиртового раствора фолликулина и помещают её в кипящую водяную баню на 5-10 минут для удаления спирта. К оставшемуся в пробирке фолликулину добавляют 0,4 мл (8 капель) H₂SO₄ (конц.) и ставят пробирку вновь в кипящую водяную баню на 5-10 минут. Жидкость в пробирке постепенно приобретает соломенно-желтое окрашивание, переходящее при нагревании в оранжевое.

Для масляного раствора фолликулина.

С масляным раствором фолликулина реакцию проводят при комнатной температуре. К 2 каплям масляного раствора фолликулина приливают 0,5 мл (10 капель) H₂SO₄ (конц.), постепенно развивается коричневое окрашивание.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 21.

Тема: «КАЧЕСТВЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ГОРМОН ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ

ЖЕЛЕЗЫ – ИНСУЛИН».

Гормон поджелужочной железы – инсулин – получил свое название потому, что он вырабатывается в островках Лангерганса. Инсулин является простым белком, влияет на углеводный обмен. При недостатке инсулина увеличивается содержание сахара в крови и выделяется большое количество сахара с мочой. Увеличение количества сахара в крови называется гипергликемией, а появление сахара в моче – глюкозурией. При введении инсулина происходит резкое снижение содержания сахара в крови.

В настоящее время инсулин широко применяется при лечении сахарного диабета. Инсулин дает характерные реакции на белок (Геллера, биуретовую, Фоля, Миллона и др.), но эти реакции неспецифичны.

ОБОРУДОВАНИЕ И РЕАКТИВЫ.Штатив с пробирками, пипетки. Раствор инсулина в ампулах, концентрированная азотная кислота, 10 и 30%-ный раствор едкого натра, 1%-ный раствор сернокислой меди, реактив Фоля (5%-ный раствор ацетата свинца).

ХОД РАБОТЫ.

1. РЕАКЦИЯ ГЕЛЛЕРА. К 10 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки приливают равный объем – 10 капель раствора инсулина. Пробирку наклоняют под углом 45° так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется белый аморфный осадок в виде небольшого кольца.

2. БИУРЕТОВАЯ РЕАКЦИЯ. К 10 каплям инсулина добавляют 5 капель 10%-ного раствора едкого натра и 3-5 капель 1%-ного раствора сернокислой меди. Перемешивают, встряхивают. Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

3. РЕАКЦИЯ ФОЛЯ. К 5 каплям раствора инсулина приливают 5 капель 30%-ного раствора едкого натра и 5 капель реактива Фоля и кипятят. Через 1–2 минуты при стоянии появляется бурый или черный осадок сернистого свинца.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА № 22.

Тема: «РЕАКЦИЯ НА БИЛИРУБИН».

Билирубин образуется из простетической группы гемоглобина-гема. Гем теряет железо и подвергается превращению. При этом образуется ряд веществ, молекулы которых представляют собой открытые цепи. Наиболее окисленным из них является биливердин, который восстанавливаясь, переходит в билирубин. Билирубин образуется в селезенке, печени, а также, по-видимому, в эритроцитах. В процессе обмена веществ билирубин вступает во временную связь, с белками тканей и жидкостей организма. Билирубин образует комплексы преимущественно с альбуминами. Билирубин обычно содержится в крови в небольших количествах (0,2-0,8 мг%). При различных поражениях печени и желтухах часто наблюдается гипербилирубинемия, когда концентрация билирубина в крови достигает 30-35 мг% (см таблицу).

Содержание билирубина в сыворотке крови в зависимости от возраста.

Возраст человека	Билирубин в мг%
Общий	Прямой	Непрямой
Новорожденный 2-й день 4-й день 6-й день 9-й день 1-й месяц Взрослый	1,35 3,17 5,27 4,21 3,10 0,65 0,65	0,51 0,51 0,46 0,51 0,51 0,15 0,15	0,84 2,86 4,81 3,70 2,51 0,50 0,50

В сыворотке крови имеются два вида билирубина: нерастворимый в воде непрямой билирубин и прямой билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, хорошо растворим в воде. Непрямой билирубин связан с альбуминами крови и дает розовое окрашивание с диазореактивом только после обработки сыворотки крови этиловым или метиловым спиртом. Эта реакция на билирубин называется непрямой. Прямой билирубин, связанный с глюкуроновой кислотой, дает прямую диазореакцию (т.е. без предварительной обработки спиртом).

У здоровых людей свободный билирубин (т.е. связанный с альбумином, нерастворимый в воде, непрямой) уходит из плазмы в печень и там переходит из свободного в связанный с глюкуроновой кислотой (т.е. в растворимый, прямой). В норме прямой билирубин составляет 75% общего билирубина крови. Прямая реакция на билирубин характерна в первую очередь для желтухи, возникшей вследствие механического препятствия оттоку желчи. Повышение непрямого билирубина является одним из основных признаков гемолитической желтухи. В печени билирубин задерживается и затем вместе с желчью в виде глюкуронида изливается в желчный пузырь. В состав желчи входит билирубин и биливердин в форме солей щелочных металлов. Билирубин имеет красновато-желтую, биливердин – зеленую окраску. Вместе с желчью билирубин и биливердин поступают в двенадцатиперстную кишку. Под влиянием микроорганизмов пищеварительного тракта часть билирубина восстанавливается в темно окрашенный пигмент кала – стеркобилиноген, который на воздухе окисляется и превращается в стеркобилин.

Схема превращения билирубина:

Билирубин + 2Н₂ ¾® мезобилирубин;

Мезобилирубин + 2Н₂ ¾® стеркобилиноген (уробилиноген);

Стеркобилиноген + 2Н₂ ¾® стеркобилин.

Часть мезобилирубиногена из тонкого кишечника всасывается в кровь, попадает в печень и вновь поступает с желчью в кишечник. Незначительное количество стеркобилирубиногена после всасывания в толстом кишечнике, минуя печень, попадает в кровь и выделяется с мочей. Стеркобилиноген является пигментом мочи, обусловливающим специфическую окраску, и носит название уробилиноген. На воздухе уробилиноген окисляется и превращается в уробилин.

ИССЛЕДУЕМЫЙ МАТЕРИАЛ: 1) сыворотка крови. 2) сыворотка крови, содержащая прямой билирубин (к консервированной сыворотке добавляют небольшое количество желчи).

РЕАКТИВЫ: 1) диазореактив приготовляется смешиванием 10 мл раствора №1 и 0,3 раствора №2 (диазореактив №1: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при подогревании в 300-400 мл дистиллированной воды, 15 мл конц. солянойкислоты и доводят водой до 1 л. Диазореактив №2: 0,5%-ный раствор азотистокислого натрия). 2) Спирт этиловый. 3) Сыворотка крови (нативная).

ОБОРУДОВАНИЕ:бюретки, штатив с пробирками, воронки, фильтры бумажные, пипетки на 1 и 2 мл, часовое стекло, стеклянные палочки.

ХОД РАБОТЫ:

Непрямая реакция. В пробирку отмеривают 1 мл сыворотки крови, 2 мл этилового спирта и фильтруют. К фильтрату добавляют 5 капель свежеприготовленного диазореактива – появляется красно-розовое окрашивание.

Прямая реакция. На часовое стекло, под которое положен лист белой бумаги, наносят каплю сыворотки крови, содержащий прямой билирубин, добавляют 3 капли свежеприготовленного диазореактива и перемешивают стеклянной палочкой. Образуется характерное для билирубина красное окрашивание.

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №

Тема: «ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ТРИАЦИЛГЛИЦЕРОЛОВ

В СЫВОРОТКЕ КРОВИ».

Триацилглицеролы омыляются гидроксидом калия в глицерин, при окислении которого возникает формальдегид. Формальдегид определяют по реакции с метилацетоном и амониевыми ионами как желтый 3,5-диацетон-1,4-дегидролутидин.

РЕАКТИВЫ: 1) Эталонный раствор триолеин 3,39 ммоль/л 2) Ацетилацетон, 0,75 г/л в растворе 20%-ного раствора изопропилового спирта. 3) Окислительный раствор 0,13 Н KIO₄ в ацетатном буфере.

4) KOH 1 моль/л. 5) Изопропиловый спирт. 6) Адсорбент.

ОБОРУДОВАНИЕ: КФК-2, водяной термостат, встряхиватель, пробирки, бюретки.

ХОД РАБОТЫ:

1. Отмечают цифрами три центрифужные пробирки.

2. В пробирку №1 помещают 0,1 мл исследуемой сыворотки крови.

3. В пробирку №2 помещают 0,1 мл эталонного раствора триолеина.

4. В пробирку №3 помещают 0,1 мл дистиллированной воды.

5. В каждую пробирку помещают по 4 мл изопропилового спирта.

6. В каждую пробирку добавить одну порцию адсорбента.

7. Содержимое пробирки в течение 10-15 минут на встряхивателе.

8. Затем центрифугируют 5 минут при 3000 оборотах в минуту.

9. Отмечают три сухих пробирки цифрами и в каждую из центрифужных пробирок отмеривают по 2 мл надосадочной жидкости и по 5 мл раствора KOH.

10. Содержимое пробирок перемешивают, пробирки закрывают пробками и инкубируют в течение 10 минут при температуре 60 ±2⁰С.

11. Охлаждают пробирки в холодной воде в течение 5 минут.

12. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл раствора KIO₄.

13. Оставляют стоять 10 минут при комнатной температуре.

14. Во все пробирки добавляют по 0,5 мл ацетилацетона и перемешивают.

15. Все пробирки инкубируют точно в течение 30 минут при температуре 60⁰С.

После охлаждения измеряют оптическую плотность содержимого пробирки.

№1 (А₁) и №2 (А₂) относительно содержимого пробирки №3 на длину волны 450-420 нм в кювете 1 см.

РАСЧЕТ: С (триацилглицеролов) (ммоль/л)= 3,39 ´ А₁/А₂.

⇐ Назад