Ход по определению аминокислот с помощью радиальной хроматографии
1. Квадрат хромато графической фильтровальной бумаги размером 11х11 см делят диагоналями на 4 части. В центре пересечения диагоналей описывается окружность радиусом 10 –11 мм, стороны квадрата нумеруют. На середину каждой их четырех дуг, ограниченных диагоналями, наносят микропипеткой пятнышко (2-3 мм в диаметре) из аминокислот "свидетелей" и анализируемую смесь аминокислот (см. рисунок).
2. В центре квадрата иглой проделывают отверстие и в него вставляют фитиль, скатанный из небольшого треугольника фильтровальной бумаги в виде трубочки.
3. На дно чашки петри наливают 10-15 мл смеси растворителей (бутанол, уксусная кислота, вода) так, чтобы было покрыто дно чашки. Квадрат помещают на чашку Петри так, чтобы он лежал на ее краях. Фитилек должен касаться дна чашки Петри. Чашку Петри накрывают крышкой и оставляют при комнатной температуре. По фитильку растворитель поднимается вверх, распределяется по бумаге от центра к периферии листа. Когда фронт растворителя дойдет до краев чашки Петри (через 1 час), хроматограмму снимают, отмечают карандашом фронт растворителя, помещают ее на крышку чашки Петри и ставят в сушильный шкаф при температуре 100 - 130°С на 5 минут (до исчезновения запаха растворителя). Высушенную хроматограмму проявляют 0,2 % раствором нингидрина в ацетоне и вновь помещают в сушильный шкаф. Через несколько минут на хроматограмме появляются пятна, указывающие положение аминокислот.
4. Для каждой аминокислоты рассчитывают коэффициент распределения Rf. Аминокислоты анализируемой смеси идентифицируют, сравнивая их с Rf аминокислоты - свидетеля.
Rf = a/b
Rтир = R1см =
Rглу = R2см =
Rлей = R3 см =
ОБЕССОЛИВАНИЕ БЕЛКОВОГО РАСТВОРА МЕТОДОМ
ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИИ
Низкомолекулярные вещества из белкового раствора можно достаточно быстро и полно уловить с помощью гель-фильтрации. Принцип, лежащий в основе этого метода, весьма прост. Хроматографическую колонку наполняют гелем, набухшим в воде или буферном растворе. Разделение веществ этим методом основано на различии в размерах молекул. Крупные молекулы не проникают в поры гранул геля и выходят из колонки в первую очередь, в то время как небольшие молекулы попадают через поры гранулы, вследствие чего задерживаются на колонке и движутся с меньшей скоростью. Метод гель-фильтрации часто называют разделением веществ по принцип молекулярного сита.
Свойствами молекулярного сита обладают многие пористые материалы. Наиболее часто для этих целей применяют органические полимеры с трехмерной структурой. Например, гели полисахарида декстрана (коммерческое название сефадексы). Существует несколько типов сефадексов, различающихся как размерами, так и количеством пор и величиной гранул. Это позволяет применять их для разделения веществ с разными размерами молекул. Благодаря высокому содержанию гидроксильных групп гранулы сефадекса легко набухают, образуя гель. Чем выше способность геля к набуханию, тем больше номер сефадекса. Для освобождения белковых растворов от солей обычно используют сефадекс марки 0-25.
Нанесение раствора белка. Перед нанесением раствора открывают кран на колонке и наблюдают за уменьшением столбика воды над слоем сеадекса. Как только над поверхностью геля остается слой жидкости толщиной 1-2 мм, кран закрывают и пипеткой аккуратно наносят на гель 1 мл белкового раствора, в который предварительно добавляют раствор К2СrО4 . Кран открывают и следят за проникновением раствора в гель. Снова закрывают кран, стенки колонки ополаскивают 1 мл дистиллированной воды, открывают кран и позволяют жидкости впитаться в гель. Затем кран закрывают, и, стараясь не взмучивать гель, аккуратно добавляют пипеткой по стенке 4-6 мл дистиллированной воды.
Сбор Фракций. В 8 пробирок отмеряют по 1 мл биуретового реактива. К колонке приливают воду и открывают кран. Собирают по 10 капель в пробирки, содержащие биуретовый реактив. Наблюдают изменение окраски в порциях элюата, содержащего белок( феолетовое окрашивание).
Выход хромата калия отмечают по появлению желтого окрашивания раствора в очередной пробирке.
Гель в колонке отмывают водой до полного удаления хромата калия. После этого колонка вновь готова к употреблению.
| № пробирки | ||||||||
| белок | - | + | - | - | - | - | - | - |
| К2СгО4 | - | - | - | - | + | + | + | - |
Отсутствие окраски обозначают знаком "-", появление окраски - знаком "+", несколько знаков "+" указывают на значительную интенсивность окраски. Выводы, полученные из результатов опыта, также заносят в протокол.
ДИАЛИЗ БЕЛКА
Диализом называется процесс разделения высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ с помощью полупроницаемых мембран (коллодий, целлофан, пергамент и др.). Обладая большим диаметром, белковые молекулы не способны проникать через такие мембраны, в то время как частицы низкомолекулярных веществ легко проходят через них.
Ход работы:
1. В пробирку наливают 2 мл р-ра альбумина и прибавляют к раствору 1 каплю насыщенного р-ра сульфата аммония. Из листа целлофана, намоченного водой, делаю мешочек (диализатор) и выливают в него содержимое пробирки. Края мешочка зажимают между двумя стеклянными палочками, прижатыми друг к другу резиновыми колечками, надетыми на концы палочек. Мешочек помещают в стакан с дистиллированной водой, укладывают палочки на края стакана. Уровень жидкости в мешочке должен быть ниже жидкости в стакане.
2. Через 1 час от начала диализа берут в 2 пробирки по 1 мл жидкости из стакана и проделывают две реакции:
а) на присутствие SO4 добавляют в первую пробирку 3-4 капли 5 % р-ра ВаС12 и наблюдают образование осадка ВаS04 в виде белой мути.
б) на присутствие белка: проделывают биуретовую реакцию. 3. Жидкость из мешочка сливают в пробирку (диализат), отмеряют 10 капель диализата и с ним тоже проделывают биуретовую реакцию.