Сопряжение окисления и фосфорилирования

Кроме π-электронов, транспортируемых от молекулы к молекуле по дыхательной цепи вдоль внутренней мембраны митохондрий, через нее (поперек) переносятся некоторые частицы: элементарные (протоны) и гораздо более крупные (например, молекулы АТФ). Транспорт протонов обеспечивает сопряжение окисления и фосфорилирования. Важнейшая роль в этом процессе принадлежит Н-АТФазе (протонной помпе), встроенной во внутреннюю митохондриальную мембрану.

За счет свободной энергии, выделяемой при транспорте по дыхательной цепи (ДЦ) пары электронов, образуются 3 молекулы АТФ. Число молекул АТФ, синтезированных при окислении того или иного вещества, определяется количеством пар электронов, поставляемых им в ДЦ. В целом восстановление О₂ до Н₂О может быть представлено в виде реакций:

Значит, в ДЦ с предшествующих этапов расщепления органических веществ в клетке должны поступать атомы водорода, являющиеся непосредственными источниками электронов, переносимых по ней. Они образуются главным образом при расщеплении воды, катализируемом специальными ферментными системами. Среди них важнейшая роль в качестве предварительной стадии окислительного фосфорилирования принадлежит так называемому циклу Кребса. От него начинаются пути многих биосинтетических процессов (синтез углеводов, липидов, белков и других сложных органических соединений).

Вместе с тем он служит основным поставщиком электронов и протонов на НАД+. В реакциях цикла Кребса образуются СО₂, Н+ и электроны, восстанавливающие НАД+ до НАДН. В курсе биохимии цикл Кребса изучается детально. Окисление одной молекулы пировиноградной кислоты без участия в этой реакции цикла Кребса дает 4 протона и 4 электрона, перенос которых по ДЦ обеспечивает синтез 6 молекул АТФ. При участии цикла Кребса в расщеплении молекулы пирувата дыхательная цепь получает 10 протонов и 10 электронов, за счет чего синтезирует 15 молекул АТФ. Следовательно, основное назначение цикла Кребса в клеточном дыхании состоит в повышении выхода свободной энергии из органических соединений путем катализа расщепления воды для образования большего количества протонов и электронов, поставляемых далее в ДЦ.

Для получения общего представления о значимости окислительного фосфорилирования в энергетическом обеспечении организма полезно количественно оценить синтез АТФ при расщеплении глюкозы. Первой стадией расщепления глюкозы служит гликолиз, в ходе которого каждая молекула распадается на 2 молекулы пировиноградной кислоты. При этом потребляются 2 и синтезируются 4 молекулы АТФ. Суммарно в результате превращения 1 моля глюкозы в пируват организм получает 2 моля АТФ. Процесс идет в анаэробных условиях. В отсутствие кислорода пировиноградная кислота восстанавливается до молочной, которая выводится из организма. Огромная энергия, заключенная в этом веществе, не используется организмом. Эффективность использования энергии при анаэробном гликолизе ничтожна — около 2%.

В аэробных условиях 2 молекулы пировиноградной кислоты, образовавшиеся при распаде молекулы глюкозы, не восстанавливаются, а окисляются далее до СО₂ с участием цикла Кребса и дыхательной цепи. В цикле Кребса синтезируются еще 2 молекулы АТФ. Далее в ДЦ поставляются 12 пар электронов, но две из них поступают не на НАД+, а через ФП на кофермент Q, обеспечивая синтез двух, а не трех молекул АТФ в расчете на пару электронов. Следовательно, за счет транспорта по ДЦ этих двух пар электронов, миновавших НАД+, синтезируются 4 молекулы АТФ. Остальные 10 пар электронов переносятся по ДЦ от НАДН до О₂, и за счет них синтезируются 30 молекул АТФ.

В целом при окислении 1 моля глюкозы происходит образование 38 молей АТФ. Эффективность использования свободной энергии при аэробном окислении глюкозы составляет при таком расчете около 42%.

Это нижняя граница возможных значений. Если же принять во внимание физиологические концентрации различных ингредиентов окисления и фосфорилирования, то эффективность использования свободной энергии достигает 60%. Вместе с тем не вся остальная энергия (40%) рассеивается в виде тепла. Много энергии затрачивает митохондрия на активный транспорт веществ через ее мембраны, т. е. преобразуется также в один из видов полезной работы организма. В сумме синтез АТФ и трансмембранный перенос веществ используют более 75% свободной энергии, освобождающийся при биологическом окислении глюкозы.

При окислении жиров образуется больше АТФ, чем при окислении углеводов, но на это уходит гораздо больше кислорода, чем на окисление глюкозы. Чтобы синтезировать 1 моль АТФ в миокарде посредством окисления жирной кислоты, нужно затратить на 17% кислорода больше, чем в аналогичном процессе с участием глюкозы. Поэтому КПД окислительного фосфорилирования при метаболизме жиров значительно ниже, чем при метаболизме углеводов.

Ключевой проблемой окислительного фосфорилирования остается механизм сопряжения транспорта электронов по ДЦ и фосфорилирования, т. е. синтеза АТФ, в митохондриях.

Существуют 3 основные гипотезы сопряжения окисления и фосфорилирования: химическая, механохимическая, химиоосмотическая.

1. Согласно химической гипотезе, посредниками между переносом электронов по ДЦ и синтезом АТФ служат неизвестные пока химические вещества, которые принимают на себя возбужденные электроны и затем переносят их на АДФ или ортофосфат для синтеза АТФ при их взаимодействии. Предпосылкой химической гипотезы явилось обнаружение таких «первичных макроэргов» в процессе синтеза АТФ при анаэробном гликолизе. В митохондриях ничего подобного не нашли, хотя тщательно искали.

2. В соответствии с механохимической гипотезой, перенос электронов дыхательными ферментами создает их напряженную конформацию, т. е. сжимает молекулу фермента наподобие пружины. Далее энергия, накопленная такой макромолекулой, предается в форме механической деформации компонентам протонной помпы, образующим с дыхательными ферментами прочные комплексы. При последующем расслаблении напряженных молекул накопленная ими энергия идет на синтез АТФ. Авторы механохимической гипотезы видят подтверждение ее основных положений в том, что перенос электронов по ДЦ сопровождается деформациями митохондриальных крист. Однако эти изменения происходят довольно медленно. Большинство исследователей считают их не причиной, а следствием окислительного фосфорилирования.

3. Основной постулат химиоосмотической гипотезы состоит в том, что энергия, освобождающаяся при окислении, вначале накапливается в форме электрического и концентрационного градиентов на внутренней мембране митохондрии, а уже они непосредственно обеспечивают преодоление энергетического барьера в реакции фосфорилирования. Химиоосмотическая гипотеза со времени создания ее П. Митчеллом в 1961 г. не опровергнута ни одним экспериментом, но и не приобрела всех необходимых прямых доказательств. И все же из года в год накапливаются аргументы в ее пользу.

Потенциальный барьер в реакции фосфорилирования АДФ преодолевается за счет работы внутренней митохондриальной мембраны, которая преобразует перепад восстановительного потенциала между начальным и конечным компонентами ДЦ в осмотическую энергию трансмембранного градиента протонов и в электрическую энергию разности потенциалов между цитозолем и митохондриальным матриксом. Поддержание определенного концентрационного градиента Н+ на митохондриальной мембране — необходимое условие сопряжения окисления и фосфорилирования, которое нарушается не только при его падении, но и при избыточном повышении. Во втором случае транспорт электронов по ДЦ тормозится, вплоть до полной остановки, а на некоторых участках они идут вспять, создавая обратный электронный поток.

По-видимому, в результате переноса электронов по ДЦ во внутренней мембране митохондрии образуется не вода, а Н⁺ и ОН-, которые благодаря векторным свойствам этой мембраны выделяются из нее по разные стороны (матрикс и межмембранное пространство) митохондрии. Вследствие высокой проницаемости наружной митохондриальной мембраны Н⁺- легко выходят в цитозоль, создавая там более низкий рН, чем в матриксе, куда протоны не могут проникнуть из-за крайне слабой проницаемости внутренней митохондриальной мембраны для них. Один акт восстановления молекулы О₂ до Н₂О приводит к выделению 4Н⁺ в цитозоль и 4ОН^- в матрикс. Избытки ионов противоположного знака по обе стороны мембраны создают на ней разность потенциалов порядка 200—250 мВ, причем митохондриальный матрикс приобретает отрицательный потенциал относительно цитозоля. Так митохондрия накапливает электрическую энергию. Митохондрии, на мембране которых поддерживается протонный градиент, называются энергизованными.

Таким образом, энергия возбужденных электронов преобразуется на внутренней мембране митохондрии в осмотическую и электрическую, вследствие чего создаемся протондвижущая сила, которая стремится обеспечить трансмембранный перенос Н+-ионов для выравнивая их концентрации внутри и вне митохондрии, но этому препятствует внутренняя мптохондриальная мембрана.

Предполагают, что вывод протонов из внутренней митохондриальной мембраны в цитозоль происходит в трех участках дыхательной цепи:

1) между НАДН и коэнзимом Q;

2) между цитохромами в и с₁;

3) между цитохромом с и цитохромоксидазой.

Наряду с дыхательной цепью важнейшим элементом, является сложный молекулярный комплекс Н-АТФазы, которая здесь выполняет функцию синтеза АТФ и поэтому называется Н-АТФсинтетазой (или Н-АТФсинтазой).

В ней выделили две части: 1) мембранную — гидрофобный белковый комплекс, образующий канал для Н+ во внутренней митохондриальной мембране (F₀) и 2) матричную — гидрофильный фактор сопряжения, выступающий из мембраны в матрикс (F₁).

Весь фермент по своему строению похож на гриб, ножку которого образует F₀, а сферическую головку — F₁. Ежесуточно он нарабатывает такое количество АТФ, которое сопоставимо с массой тела взрослого человека с КПД почти 100%.

Можно считать доказанным, что ферментативная активность Н-АТФсинтетазы непосредственно связана с вращением ее γ-субъединицы в полости гексамера. При таком повороте изменяется конформация всех трех каталитических (т. е. катализирующих реакцию АДФ + Н₃Р0₄ = АТФ + Н₂0) β-субъединиц комплекса F₁, что и обеспечивает активирование фермента. Он работает как электромотор, подвижная часть которого вращается при пропускании электрического тока через обмотку. В отличие от технических электромоторов, в Н-АТФсинтетазе ток через обмотку статора обусловлен потоком не электронов, а протонов.

Если Н+-ионы пойдут из цитозоля в матрикс не по каналу в F₀, а иначе, то АТФ не синтезируется даже при весьма интенсивном транспорте электронов по дыхательной цепи и обусловленным им выбросе Н⁺-ионов в цитозоль (с закислением его) .Такое состояние возникает не только под действием искусственных протонофоров, но и имеет место в естественных условиях в так называемом буром жире. Эта ткань присутствует у эмбрионов и новорожденных детей, а также у животных, впадающих в зимнюю спячку. Во внутренних мембранах митохондрий клеток бурого жира содержится особый транспортный белок (естественный протонофор), который позволяет Н+-ионам свободно переходить в сторону более низкого электрохимического потенциала из цитозоля в митохондриальный матрикс, минуя канал F₀. В результате клетки бурого жира весьма интенсивно окисляют жир, но энергия возбужденных л-электронов преобразуется преимущественно в тепло, а не в химическую энергию синтеза АТФ. Это важный механизм защиты организма от переохлаждения.

Как только протонный канал в F₀ открывается, в него устремляются ионы водорода из цитозоля — возникает протонный электрический ток в «обмотках» молекулярного электромотора (Н-АТФсинтетазы). Поток заряженных частиц (Н+) приводит в движение его ротор (у-субъединицу комплекса F₁), Вращение у-субъединицы в статоре Н-АТФсинтетазы происходит скачками (дискретно) с шагом в 120°. Для совершения ротором такого шага через канал должны пройти 2—3 иона водорода. При каждом скачке развивается усилие в 40 пиконьютонов и синтезируется 1 молекула АТФ. Полный оборот ротора происходит за 3 скачка — при этом образуются 3 молекулы АТФ.