Образование и окисление молекулярного водорода

По распространению в биосфере водород занимает третье ме­сто после углерода и кислорода (отлат. hydrogene — рождающий воду). Он входит в состав самого распространенного в биосфере вещества — воды. Водород содержится во всех органических со­единениях, в природных газах, залежах нефти, торфа и угля. В почве водород входит в состав гумуса. В атмосфере его очень мало, хотя из микрогазов атмосферы по значению и масштабам круговорота водород занимает первое место.

В обычных условиях водород вступает в реакции лишь с не­многими элементами, но при нагревании дает радикал Н⁺ и вза­имодействует со многими элементами. Соединяясь с кислоро­дом, он образует воду и при этом выделяется очень много энергии, в связи с чем реакция получила название «гремучего газа», так как она протекает со взрывом:

Н₂ + 1/2 0₂ = Н₂0 + 68,3 ккал/моль.

Реакция с азотом проходит с большими затратами энергии. Она возможна при высокой температуре, давлении и в присутст­вии катализаторов:

ЗН₂ + N₂ = 2NH₃.

Этот процесс лежит в основе получения азотных удобрений по методу Габера-Боша.

Образование метана идет без катализаторов при высокой тем­пературе:

2Н₂+ С = СН₄.

В биохимических процессах трансгидрирования водород участ­вует в реакции переноса электронов и протонов.

Круговорот молекулярного водорода в биосфере включает его образование и окисление в результате биогенных и абиогенных — геохимических и промышленных процессов.

Главный источник биогенного водорода — деятельность мик­роорганизмов в почве. Водород образуется также в рубце жвач­ных и пищеварительном тракте других животных, включая чело­века. Учесть количество водорода, выделяемого почвенными микроорганизмами, довольно сложно из-за того, что его образо­вание в природных ассоциациях сопряжено с параллельно иду­щими процессами потребления.

3 Микробиологические процессы образования водорода Один из первых описанных природных процессов микробного образова­ния водорода — сбраживание целлюлозы в анаэробных условиях смешанными культурами бактерий. Первичные анаэробы, осу­ществляющие брожение, выступают в роли главных генераторов водорода в анаэробной зоне. К облигатным вторичным анаэро­бам, образующим водород, относятся сульфатредуцирующие бак­терии, к факультативным — энтеробактерии. В анаэробных ус­ловиях водород образуют некоторые простейшие — симбионты животных, обитающие в их кишечном тракте. В аэробной зоне водород продуцируют азотфиксаторы, метанотрофы и фототрофные организмы — водоросли, цианобактерии, фотосинтезирую­щие пурпурные и зеленые бактерии.

Механизмы образования водорода у многочисленных групп микроорганизмов, участвующих в этом процессе, различны. У большинства хемотрофных бактерий образование водорода со­пряжено с процессами получения энергии. Конечным акцепто­ром электронов выступают протоны Н, что определяется нали­чием специфического фермента — гидрогеназы, катализирующего реакцию 2Н⁺ + 2е -» Н₂; переносчик электронов, с которым взаи­модействует гидрогеназа — железосодержащий фермент ферредоксин. У азотфиксаторов в образовании водорода принимает участие Fe-Мо-содержащий фермент нитрогеназа, который ка­тализирует восстановление не только азота, но и протонов Н. Этот процесс идет с затратой АТФ. Нитрогеназа катализирует образование водорода и у фототрофных азотфиксаторов. У водо­рослей и цианобактерий выделение водорода связано с фотоли­зом воды.

Таким образом, условия, способствующие активному образо­ванию водорода в почве, сводятся к наличию в анаэробной зоне сбраживаемых органических субстратов, а в аэробной зоне — к активации фотосинтеза.

4 Потребление водорода Считают, что потребление молекуляр­ного водорода в почвах на Земле составляет 10⁸ т в год. Образую­щийся в почве водород активно поглощается «бактериальным фильтром», поэтому в природной обстановке его трудно обнару­жить, хотя в чистых культурах выделение водорода легко регист­рируется. Потребление водорода микроорганизмами происходит наиболее активно в аэробной зоне, хотя частично он потребляется и вторичными анаэробами. Водород используют разными путями и с участием разных акцепторов электрона микроорганизмы мно­гих таксономических, трофических и физиологических групп.

Водородными называют большую и разнородную в таксоно­мическом отношении группу бактерий, которые в аэробных ус­ловиях окисляют водород и способны к автотрофному росту. По­чти все они факультативные автотрофы. Многие ассимилируют N₃, а в анаэробных условиях способны к окислению водорода кислородом нитратов или нитритов, восстанавливая их до N₂.

К водородным бактериям, которые могут использовать водо­род и строить свое тело из С0₂, относят десятки обычных родов бактерий, которые могут развиваться и за счет органических ве­ществ. Это грамотрицательные Hydrogenobacter, Hydrogenophaga, Azospirillum, Alcaligenes, Aquaspirillum, Rhizobium, почкующиеся Blastobacter, Hyphomicrobium, а также грамположительные кори- неподобные бактерии родов Arthrobacter, Nocardia, Mycobacterium,Streptomyces и некоторые виды споровых рода Bacillus. Таким об­разом, хемолитоавтотрофия на основе окисления водорода — более распространенное среди бактерий явление, чем при окислении других неорганических субстратов. Они осуществляют реакцию Н₂ + 0,5 0₂ = Н₂0. У них имеется цикл Кальвина или они ведут превращения как метаногены.

В клубеньках бобовых растений при активности бактероидов наблюдается процесс рециклизации водорода. Образуемый нит- рогеназой Н₂ частично окисляется кислородом и синтезирует АТФ. В то же время водород выступает как донор электронов для нит- рогеназы и обеспечивает ассимиляцию С0₂. При этом потери водорода составляют всего 4 вместо 25% по расчету. Это способствует высокой эффективности использования клубень­ковыми бактериями продуктов фотосинтеза растений (использо­вания энергии).

Водородные бактерии перспективны как продуценты белка. Их используют также для биорегенерации воздуха (удаления избытка С0₂) в замкнутых системах, где водород можно получать электро­лизом воды. Водородные бактерии служат источником для полу­чения ферментов, особенно гидрогеназ. Гидрогеназы ведут про­цесс в двух направлениях: Н₂ 2Н⁺ + 2е (фермент содержит никель).

В почве водородные бактерии, по-видимому, создают микроконсорции, в которых они выступают автотрофным центром. Их спутниками-консументами могут быть простейшие, паразитиче­ские бактерии-бделловибрионы, микоплазмы, миксобактерии со способностью лизировать клетки других бактерий.

На основе межвидового переноса водорода за счет его образо­вания и потребления в природных экосистемах создаются проч­ные микробные ассоциации, члены которых иногда трудно по­лучить в виде чистых культур. Таковы многие ассоциации с участием метаногенных бактерий, целлюлозосбраживаюших ана­эробов, азотфиксаторов. Деятельность такого рода ассоциаций обеспечивает активное протекание сложных многоступенчатых процессов превращения полимерных субстратов в почве, таких как разложение целлюлозы, пектина, ароматических соединений. Водород в этих процессах выступает как ключевой метаболит, связывающий в одну систему работу многих микроорганизмов аэробной и анаэробной зон.

Контрольные вопросы:

1. Превращение кислорода
2. Микроорганизмы и свободный кислород
3. Значение кислорода для микроорганизмов
4. Синглетный кислорода
5. Водород и его производные
6. Потребление водорода микроорганизмами
7. Соединения водорода и их роль
8. Микробиологические процессы образования водорода
9. Образование и окисление молекулярного водорода
10. Получения азотных удобрений по методу Габера-Боша

Литература:

13. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв: Учебник. - 3-е изд., испр. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 2005.

14. Звягинцев Д.Г. Микроорганизмы и почва. М.: МГУ, 1987.

15. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 1989. с.336.

16. Мирчинк Т.Г.Почвенная микология .-М.: Изд. МГУ,1986.

4. Емцов В. Т.Микробы, почва, урожай. – М.: Изд. Колос,1980.

5. Илялетдинов А.Н.Микробиологические превращения азотосодержащих соединений в почве. Алма – Ата, 1976.

6. Почвенная микробиология./ Под ред. Д.И. Никитина /- М.: Изд. Колос,1979.

Лекция 11

Круговорот азота

Цель лекции:изучить пути образование и окисление азота в почве, а также процессы нитрификации и денитрификации азота

Ключевые слова:азот, молекулярный азот, биологическая фиксации, окисление, разложение, круговорот, микроорганизмы, клубеньковые бактерии, нитрификация и денитрификация

Вопросы:

1. Биологическая фиксация азота

2. Аммонификация

3. Нитрификация

4. Денитрификация

Азот — один из главных биофильных элементов. Он входит в состав основных полимеров любой живой клетки — белков-фер­ментов и структурных белков, нуклеиновых и аденозинфосфор- ных кислот. Его превращения в биосфере во многом определяют работу главного звена биологического цикла — образование пер­вичной растительной продукции.

Большие запасы азота на Земле представлены его восстанов­ленной формой — газообразным азотом воздуха N₂ (79%). Кроме того азот встречается в различных восстановленных и окислен­ных формах (N₂, NH₃, N₂0, NO, N0₂, N0₃), которые входят в состав атмосферы Земли и содержатся в почве.

В почве иммобилизовано азота в гумусе и биомассе микроорга­низмов в три раза больше, чем в растениях и животных вместе взятых. При этом азот в пахотной почве часто бывает в первом минимуме с точки зрения обеспечения питания растений, так как основная масса почвенного азота заключена в недоступных расте­ниям сложных органических соединениях, которые минерализу­ются очень медленно. Это приводит к необходимости в условиях ведения сельского хозяйства с отчуждением урожая подкармли­вать растения вносимыми в почву азотными удобрениями.

Из почвы на Земле с урожаем происходит постоянный вынос азота, превышающий 100-200 млн т/год. Производство минераль­ных азотных удобрений, исчисляемое 70-80 млн т/год (по азоту), требует больших энергозатрат, которые в развитых странах со­ставляют 40% и более от общего объема энергопотребления в сельском хозяйстве. В то же время коэффициент их использова­ния растениями не превышает 30-50%. Следовательно, при ши­роком применении минеральных азотных удобрений очень мно­го азота не включается в урожай и его избытки вызывают загрязнение отдельных экосистем и биосферы в целом, что при­водит к негативным последствиям (загрязнение избытком азота природных вод, загрязнение атмосферы окислами азота). Избы­ток связанного минерального азота очень вреден для биосферы. Таким образом, проблема азота превратилась в глобальную эко­логическую и социальную проблему. В связи с проблемой азота должны решаться важнейшие задачи жизнеобеспечения челове­чества: снижение энергозатрат на минеральные удобрения, охра­на природной среды, разработка оптимизированных режимов для почвы с целью получения высоких урожаев без нарушения по­тенциального плодородия из-за потерь гумуса, создание новых способов контроля и управления биологическим азотом (азотфиксацией). Имеются предложения по решению проблемы азотфиксации: 1) передать гены азотфиксации растениям и прежде всего важным для сельского хозяйства злакам, 2) вызвать образо­вание азотфиксирующих клубеньков у небобовых растений, преж­де всего у пшеницы, кукурузы и др., 3) активизировать азотфиксацию у свобод ножи вуших или ассоциативных бактерий, 4) получать азотные удобрения в заводских условиях с помощью нитрогеназы и т.д. Несмотря на огромные усилия международного сооб­щества ученых на протяжении последних 40 лет ни одна из по­ставленных задач, к сожалению, не была выполнена. Необходимы дальнейшие исследования и новые идеи.

Круговорот азота в природе разбивается на несколько основ­ных звеньев, в которых главными агентами выступают микроор­ганизмы. В этом цикле азот участвует в газообразной форме, в виде минеральных и органических соединений. При фиксации азота микроорганизмами происходит его восстановле­ние до аммиака с последующим включением в аминокислоты; разложение органических азотсодержащих соединений (аммони­фикация) приводит к освобождению азота в форме аммиака, ко­торый далее окисляется последовательно до нитритов и нитратов (нитрификация). Окисленный азот вновь восстанавливается до N₂ в процессе денитрификации. Аммонийные и нитратные фор­мы соединений азота ассимилируются растениями и микроорга­низмами, что приводит к временному закреплению азота в орга­нических веществах, его иммобилизации в микробной биомассе. В процессах нитрификации и денитрификации возможны газо­образные потери азота в форме его закиси — N₂0.

1 Биологическая фиксация азотаПроблема азотного баланса почв и азотного питания расте­ний — одна из центральных в почвоведении и агрохимии. От ее правильного решения зависит продуктивность и сохранение поч­венного плодородия при многолетней эксплуатации земель и сохранение биосферы. В современный период эта проблема свя­зывается с выяснением роли и значения «биологического азота». Под этим термином понимают азот, включенный в растения бла­годаря азотфиксации.

В естественных экосистемах растения используют азот из раз­ных источников: из минеральных форм, из органических веществ в том числе и гумуса после его разложения микроорганизмами и от бактерий азотфиксаторов, связывающих молекулярный азот, который в форме аммония и аминокислот поступает в клетки корня. В агроценозах растения дополнительно получают азот из вносимых в почву минеральных и органических удобрений. Азот, включенный в биомассу растений в результате фиксации его бак­териями, называют биологическим, а сами бактерии, связываю­щие молекулярный азот, — азотфиксаторами, или диазотрофами. Доля биологического азота в урожае по разным оценкам колеб­лется от 20 до 90%. Очень много биологического азота могут по­лучать бобовые растения за счет симбиоза с клубеньковыми бак­териями азотфиксаторами. Микробное связывание молекулярного азота — единственный путь снабжения растений азотом, не веду­щий к нарушению экологической среды. Обратный эффект дает применение минеральных азотных удобрений.

Суммарная годовая продукция азотфиксации в экосистемах на Земле не известна, но, вероятно, она очень велика. В сельско­хозяйственные угодья вносится 30% связанного азота в виде ми­неральных азотных удобрений. В основе производства удобре­ний лежит способ, разработанный в Германии и получивший название метода Габера-Боша. Он заключается в синтезе аммиа­ка из молекулярного азота и водорода на катализаторах при вы­сокой температуре и давлении. Это производство очень энерго­емкое и сильно загрязняет окружающую среду.

В молекуле азота существует очень прочная тройная связь, которая обеспечивает инертность газообразного азота. Для перевода одной молекулы N2 b две молекулы аммиака требуется 225 ккал:

Биологический процесс восстановления азота представляет собой цепь ферментативных реакций, в которых главную роль играет фермент нитрогеназа. Активный центр этого фермента состоит из комплекса двух белков, содержащих железо, серу и молибден в соотношении Fe:S:Mo = 6:8:1. Выделена также ванадийсодержашая нитрогеназа, уровень активности которой на 30% ниже, чем у монитрогеназы.

Азот, растворенный в воде, поступает в азотфиксирующий центр, где в его активации участвуют два атома молибдена. После взаимодействия с азотом молибден восстанавливается за счет электронов, поступающих в активный центр через Fe-белок и Mo-Fe-белок. Этот перенос сопряжен с реакцией разложения АТФ, т.е. он идет с затратой энергии. В передаче электронов нитрогеназе участвует же лезосодержащий водорастворимый белок — фермент ферредоксин, а в активации водорода воды и переносе протонов — фермент гидрогеназа. Реакции, происходящие при работе нитрогеназы

Образование нитрогеназы у бактерий связано с наличием осо­бых nif-генов, содержащихся или в ядерной ДНК или в плазми­де, ответственной за синтез этих специфических ферментных белков. Гены диазотрофности высоко консервативны и широко распространены у бактерий благодаря существованию эффектив­ных систем обмена генетической информацией. В то же время диазотрофы не встречаются среди эукариот. Долгое время не об­наруживали азотфиксаторов и среди архебактерий. Однако в пос­леднее время стало известно, что метаногены имеют особую термостабильную ферментную систему азотфиксации, отличную от термолабильной системы эубактерий. Таким образом, хотя свой­ство фиксировать азот присуще многим организмам, оно огра­ничено только царством прокариот.

У бактерий-азотфиксаторов встречаются все известные типы метаболизма. Среди них есть аэробы с дыхательным энергети­ческим обменом, анаэробы, осуществляющие брожение, хемоорганотрофы, автотрофы-фотосинтетики и хемолитоавтотрофы. Фиксация молекулярного азота для них не обязательный про­цесс, так как в присутствии азота в другой форме — минераль­ной или органической — они обеспечивают свои потребности связанным азотом.

Большое значение для активной азотфиксации имеет концент­рация кислорода, так как фермент нитрогеназа подавляется мо­лекулярным кислородом. У разных микроорганизмов выработа­лись различные механизмы защиты нитрогеназного комплекса от кислорода.

У аэробных бактерий-диазотрофов (например, азотобактера) происходит активное связывание кислорода за счет повышения уровня дыхания при азотфиксации. Для быстрого расхода кисло­рода часть органических молекул сжигается клеткой «непроизво­дительно», т.е. путем окисления без запасания энергии. Другой механизм зашиты нитрогеназы в аэробных условиях — конформационное изменение тех компонентов ферментных белков, которые чувствительны к кислороду, а также связывание последних в ста­бильные комплексы с помощью специальных FeS-белков.

У цианобактерий, выделяющих кислород внутриклеточно при фотосинтезе, процесс азотфиксации перемещен в нефотосинте­зирующие гетероцисты, где он пространственно изолирован от кислорода. Симбиотические клубеньковые бактерии защищены тканью клубенька и, кроме того, у них имеется леггемоглобин, который транспортирует необходимый для дыхания кислород непосредственно к бактероидам в менее активном связанном виде.

Азотфиксирующие бактерии по их связи с растениями делят на свободноживущие и симбиотические. В первой группе разли­чают свободноживущие бактерии, которые не связаны непосред­ственно с корневыми системами растений, и ассоциативные, обитающие в сфере прямого влияния растения, в прилегающей к корням почве (ризосфере) или на поверхности корней (в ризоплане) и листьев (в филлоплане). К симбиотическим бактериям относятся те, которые живут в тканях растения, стимулируя об­разование особых разрастаний на корнях или листьях в форме клубеньков.

Симбиоз контролируется комплексом соответствующих ком­плементарных генов растения и бактерии.

Исследования показали, что некоторые бактерии не фиксиру­ют азот. Вероятно не удалось подобрать условия для осуществле­ния этого процесса. На протяжении 70 лет не удавалось устано­вить азотфиксацию у чистых культур клубеньковых бактерий, так как не были подобраны подходящие условия. Достаточно было понизить парциальное давление кислорода и они начали фикси­ровать азот.

Так называемые свободноживущие азотфиксаторы распрост­ранены повсеместно и встречаются среди бактерий самых раз­ных таксономических групп, относящихся как к хемотрофам, так и фототрофам, к аэробам и анаэробам. Первый диазотрофный микроорганизм был обнаружен в конце XIX в. (1898 г.) С.Н. Ви­ноградским среди анаэробных маслянокислых бактерий родаClostridium. Он назвал его в честь Пастера Clostridium pasteurianum. Вскоре (1901 г.) М. Бейеринком в Голландии был выделен аэроб­ный азотфиксатор, получивший за свою морфологию и цвет (кок­ковидные бактерии, колонии которых с возрастом темнеют до шоколадного цвета) название Azotobacter chroococcum. Впоследст­вии способность к связыванию молекулярного азота была уста­новлена у огромного числа почвенных бактерий, в том числе и у цианобактерий (прежнее название — синезеленые водоросли).

В благоприятных условиях, например на затопляемых почвах рисовников, прибавка азота за счет деятельности цианобактерий может достигать 25-50 кг/га в год. В зональных автоморфных почвах и в агроценозах их вклад в общее азотонакопление не превышает нескольких килограммов азота в год на 1 га.

Суммарная годовая потенциальная продукция азота свободноживущими азотфиксаторами (в условиях лабораторных экспе­риментов с внесением источников углерода) для разных почв разная и колеблется от десятков до сотен килограммов на гектар (кг/га в год): дерново-подзолистые 30-200; серые лесные 50-200; черноземы и черноземно-луговые 90-300; каштановые 100-300; сероземы 100-400.

Ассоциативной азотфиксацией называют накопление азота микроорганизмами, живущими в ассоциации с первичными про­дуцентами органического вещества — растениями, водорослями или цианобактериями. Эффект высокой нитрогеназной актив­ности в этих ассоциациях связан с поступлением к бактериям от фототрофов легкодоступных источников углерода и энергии в виде экссудатов листьев и корней, внеклеточных слизей циано­бактерий, корневого отпада и опада.

Влияние растений на азотонакопление в прикорневой зоне небобовых растений было отмечено еще в 1926 г. академиком С.П. Костычевым на примере табака и азотобактера. Процесс ассоциативной азотфиксации тесно сопряжен с фотосинтезом. Он протекает не только в корневой зоне, но и филлосфере, при­чем на долю последней приходится 10% фиксированного азота. Связующим звеном между фотосинтезом и азотфиксацией слу­жат прижизненные выделения корнями органических веществ. Это могут быть сахара и органические кислоты, полисахаридные слизи (муцигель) и другие экссудаты.

Общее количество органических соединений, выделяемых кор­нями, может составлять до 30-40% от суммарной продукции фо­тосинтеза за вегетационный период, что было установлено, ког­да растению давали меченую С0₂. Исходя из этого расчета следует оценивать ассоциативную азотфиксацию примерно в 10-25 кг N₂ на 1 га в год для почв средней полосы и до 50-100 кг — в суб­тропической и тропической зонах, однако пока такие расчеты остаются очень неточными. В длительных опытах, проведенных в нашей стране и за рубежом, было показано, что потери азота из почвы, в которую азотные удобрения не вносили, минимальны даже в случае монокультур небобовых растений по сравнению с почвами бессменного пара.

Поступающие в почву через корни органические вещества активизируют деятельность не только диазотрофов, но и микро­организмов, разлагающих гумус. Таким образом, мобилизация азота в системе «почва-микроорганизмы-растение» происходит по двум каналам — связывание его из атмосферы и извлечение из органических веществ почвы. Включение того или иного про­цесса и их эффективность определяются наличием в почве легко­доступного азота. При внесении азотных удобрений микроорга­низмы переходят от азотфиксации к связыванию (иммобилизации) растворимых форм азота с частичными потерями N₂ в атмосферу за счет денитрификации. По мере увеличения соотношения уг­лерода и азота в среде активизируется процесс азотфиксации, а усиление фотосинтетической деятельности растений приводит к возрастанию степени минерализации гумуса.

Вскрытие механизмов работы живой системы почвы приводит к пониманию путей управления этой системой. Применение сба­лансированных доз азотных удобрений, повышая фотосинтетическую активность растения, косвенно способствует усилению азотфиксации и увеличивает долю биологического азота в урожае.

Ассоциативные микробы-диазотрофы есть и у животных. До­казана способность к азотфиксации у бактерий кишечной груп­пы рода Escherichia, обитающих в качестве комменсалов в пи­щеварительном тракте человека. Азотфиксаторы обитают в пищеварительном тракте всех позвоночных и беспозвоночных животных. Сколько они фиксируют азота в реальных условиях, остается неизвестным. Эта область исследований еще мало раз­работана, и микробные ассоциации во многих случаях плохо иден­тифицированы. Особый интерес вызывают животные, питающие­ся кормом, содержащим мало азота (жвачные, грызуны, термиты).

Симбиотическая азотфиксация — важнейший резерв биологи­ческого азота в почве. Микробные азотфиксирующие симбион­ты описаны у многих видов разных растений. Проникая в ткани растения, они вызывают опухолевидные разрастания в форме клубеньков на корнях или стеблях.

Наиболее активные и хорошо изученные диазотрофные сим­бионты — клубеньковые бактерии бобовых растений. Семейство бобовых содержит 674 рода и 19 тыс. видов, из которых 200 ис­пользуются в сельском хозяйстве. Бобовые распространены по всему миру и по значению занимают второе место после злаков. Уникальным свойством бобовых является формирование корне­вых клубеньков как у культурных, так и у дикорастущих расте­ний. Однако не все бобовые образуют клубеньки, большинство видов даже не исследовано в этом отношении.

Образование клубеньков и последующее развитие азотфиксирующего симбиоза у бобовых происходит в ответ на инфициро­вание бактериями нескольких родов, относящихся к семейству Rhizobiaceae. В природе и в сельском хозяйстве эти симбиозы играют важную роль как поставщики связанного азота. Не все представители семейства Rhizobiaceae являются полезными. Не­которые виды рода Agrobacterium вызывают болезни растений. Представители рода Phyllobacteriumобразуют клубеньки на ли­стьях некоторых растений, значение которых пока не ясно.

Первым в чистую культуру бактерии из клубеньков выделил М. Бейеринк. Систематика клубеньковых бактерий первоначально строилась на названии растения хозяина, была очень проста, понятна и удобна для практического использования клубенько­вых бактерий при инокуляции бобовых растений. Это были клу­беньковые бактерии клевера, гороха, сои, люпина, люцерны и др. Все они относились к одному роду Rhizobium. Однако в послед­нее время особенно в связи с глубокими и разносторонними ис­следованиями нуклеиновых кислот оказалось, что это очень раз­нородная группа бактерий и часто резко отличающиеся бактерии образуют клубеньки на одном и том же растении и даже один вид бактерий может иметь много растений-хозяев.

В настоящее время выделяют по меньшей мере четыре рода клубеньковых бактерий:

1) Rhizobium, например Rhizobium leguminosarum bv trifolii (кле­вер), bv viceae (горох), bv meliloti (люцерна). Это быстрора­стущие бактерии;

2) Sinorhizobium(вика, люцерна, соевые, у сесбании клубень­ки образуются на стебле);

3) Mezorhizobium;

4) Bradyrhizobium, например Bradyrhizobium japonicum(соя). Это медленнорастущие бактерии.

Обозначение bv — биовариант.

Гены азотфиксации у некоторых родов располагаются на плаз­миде, у других — на хромосоме.

Благодаря азотфиксирующим симбионтам бобовые обогаща­ют почву азотом. В зависимости от условий роста растений они накапливают азот от 60 до 300 кг/га в год.

Вскоре после открытия роли клубеньковых бактерий в накоп­лении азота попытались использовать эти бактерии для обработ­ки семян бобовых перед посевом. Приготовленные на основе клубеньковых бактерий препараты получили в разных странах разные названия. Изготовленный впервые в Германии в 1896 г. препарат был назван нитрагином; в 1906 г. он был получен в Англии, в 1907 г.— в США. В Чехословакии препарат клубень­ковых называли нитразоном, в Австралии — нитрофиксом. В России первые партии нитрагина были изготовлены в 1930-1935 гг.

Первый очень важный этап при изготовлении нитрагина со­стоит в выделении и подборе производственного штамма клубень­ковых бактерий. К каждой культуре бобового растения нужно под­бирать соответствующие ему штаммы: для клевера клубеньковые бактерии клевера, для гороха клубеньковые бактерии гороха, для люпина бактерии люпина. Выделяют бактерии обычно непо­средственно из клубенька. Берут крупный клубенек розового цве­та, окрашенный леггемоглобином, стерилизуют его поверхность сулемой или каким-либо другим антисептиком, разрезают сте­рильным скальпелем, извлекают небольшое количество расти­тельной ткани и шпателем растирают ее по поверхности бобово­го агара в чашке Петри. Отобранный штамм должен отличаться следующими свойствами: специфичностью по отношению к .определенному растению, 2) генетической устойчивостью, 3) свой­ством доминирования, т.е. способностью быстро размножаться в почве и численно доминировать над местными малоэффектив­ными штаммами, которые могут находиться в почве, 4) инвазивностью — способностью проникать в корни растений, активностью, т.е. высокой способностью к азотфиксации, 6) эф­фективностью — способностью повышать урожай. Он должен образовывать большие немногочисленные розовые от леггемоглобина клубеньки. Образование большого количества мелких белых клубеньков свидетельствует о том, что этот штамм плохой. Хорошо развитые клубеньки образуют вещества, препятствую­щие дальнейшему клубенькообразованию. Лучшим способом, по которому можно судить о ценности штамма, является определе­ние прибавки урожая, которую он дает. Этот метод имеет только тот недостаток, что он очень трудоемок. Если, например, испы­тывается сто штаммов, нужно иметь множество опытных деля­нок и проводить эксперименты минимум три года. Кроме того, урожай зависит от множества факторов и вычленить среди них влияние азотфиксации не так-то просто.

В России микробиологическая промышленность на основе клубеньковых бактерий выпускает препарат ризоторфин (торфя­ной нитрагин).

Технология производства ризоторфина заключается в сле­дующем:

1) выращивание жидкой культуры клубеньковых бактерии в колбе (посевной материал), 2) выращивание бактерий в большом ферментере, в который вносится посевной материал, 3) подго­товка торфа для заражения культурой (нейтрализация реакции среды, внесение питательных добавок, NPK, микроэлементов, органических веществ), раскладывание влажного торфа в поли­этиленовые пакеты, герметизация пакетов, стерилизация у-лучами, 4) внесение в пакет с помощью шприца клубеньковых бакте­рий, 5) двухнедельное подращивание бактерий в торфе при комнатной температуре с увеличением численности бактерий в 100 раз и более, 6) хранение ризоторфина в холодильнике до 6-8 месяцев. При этом титр клубеньковых бактерий не должен сильно падать.

Ризоторфин предназначен для предпосевной обработки семян зернобобовых культур и бобовых трав: гороха, люпина, сои, вики, фасоли, люцерны, клевера и др. Для каждого вида бобовых рас­тений ризоторфин готовится отдельно из разных видов клубень­ковых бактерий. Препарат представляет собой сыпучую массу с влажностью 50-100%. В 1 г препарата содержится не менее 200 млн клеток клубеньковых бактерий.

Гектарная порция ризоторфина 200 г. Предпосевная обработка семян производится путем разбавления препарата в воде и зама­чивания семян в день посева. При использовании ризоторфина нельзя применять ядохимикаты (фунгициды, инсектициды).

Клубеньковые бактерии почти полностью обеспечивают по­требности растений в азоте. Многолетняя практика применения ризоторфина показывает, что он сильно повышает урожай сои, гороха, люцерны и клевера. При этом содержание белка в урожае существенно повышается. Наиболее высокий хозяйственный эффект ризоторфин дает лишь при соблюдении прогрессивной технологии возделывания бобовых культур. Высев обработанных ризоторфином семян необходимо производить во влажную поч­ву, удобренную фосфором, калием и микроэлементами, особен­но молибденом. На почвах слабоокультуренных, бедных азотом, применение ризоторфина следует сочетать с внесением неболь­ших доз минеральных азотных удобрений — не более 45 кг/га. На хорошо окультуренных почвах использование ризоторфина исключает необходимость внесения минерального азота под все виды бобовых.

Инокуляция бобовых клубеньковыми бактериями особенно эффективна на площадях, где ранее не возделывалась данная бобовая культура и соответствующие специфичные бактерии в почве отсутствуют. В почве после посева бобовых клубеньковые бактерии сохраняют высокий титр до 5 лет.

Валовое содержание азота в почве может быть высоким и в черноземах достигает Ют/га. Однако почти 99% его связано в органических соединениях, в том числе в гумусе, поэтому он недоступен для растений и обычно выступает в качестве основ­ного лимитирующего фактора роста растений в сельском хозяйст­ве. Процесс минерализации азотсодержащих органических со­единений с выделением аммиака называется аммонификацией. Этому процессу подвержены белки и их производные — пептиды и аминокислоты, нуклеиновые кислоты и их дериваты — пури­новые и пиримидиновые основания, мочевина и мочевая кисло­та, азотсодержащий полисахарид хитин и гумусовые кислоты. Уже в конце XIX в. француз Э. Маршель показал, что процесс аммо­нификации носит универсальный характер и осуществляется многими микроорганизмами в широком диапазоне условий.

2 Аммонификация Это наиболее динамичное звено в цикле азота. При внеклеточных превращениях белков конечным продук­том являются аминокислоты. В процессе участвуют разнообразные протеазы очень многих микроорганизмов (бактерий и грибов). Да­лее аминокислоты либо поступают в клетки микроорганизмов, либо вовлекаются в химические реакции в почве. Внутриклеточные превращения аминокислот возможны по четырем направлениям: синтез белка, переаминирование, декарбоксилирование и дезами­нирование. Последнее приводит к выделению свободного аммиака. В аэробных условиях кроме аммиака при аммонифика­ции образуются С0₂ и окислы серы, а в анаэробных — жирные и ароматические кислоты (бензойная, ферулиновая и др.), спирты, неприятно пахнущие продукты (индол, скатол, метилмеркаптан) и ядовитые амины — кадаверин, путресцин.

Образующиеся в переувлажненных почвах при анаэробиозе продукты аммонификации обладают фитотоксическими свойства­ми и могут вызывать угнетение роста растений.

В процессе аммонификации помимо бактерий участвуют ак­тиномицеты и грибы. Активные возбудители аммонификации известны среди разнообразных аэробных и анаэробных бактерий из многих родов. Это малоспецифическая функция. Для процес­са аммонификации большое значение имеет соотношение С : N в разлагаемом субстрате. Чем меньше это отношение, тем выше эффективность аммонификации, определяемой по количеству NH₃ от общего количества превращенного азота. На каждые 50 г разложенного органического вещества бактерии используют на синтез белка биомассы 2 г азота (С : N = 25). При содержании азота в органическом веществе разлагающейся растительной массы менее 2% он будет полностью иммобилизован в клетках микро­организмов, а при более высоком его содержании (С : N < 25) будет выделяться аммиак. Это проявляется при использовании разных органических удобрений. Отношение С : N в навозе низ­кое, и его разложение поэтому сопровождается накоплением ам­миака, а для соломы С : N высокое и внесение в почву соломы без минеральных азотных удобрений приводит к иммобилиза­ции, т.е. к закреплению всего азота в микробных клетках и азот­ному голоданию растений.

Аммонификация нуклеиновых кислот.Помимо внутриклеточ­ных превращений нуклеиновых кислот они подвергаются вне­клеточному распаду под действием нуклеаз, выделяемых микро­организмами во внешнюю среду. Внеклеточные ДНК-азы и РНК-азы найдены у многих микроорганизмов. Аммиак выделя­ется при распаде пуриновых и пиримидиновых оснований, вхо­дящих в состав нуклеиновых кислот.

Аммонификация мочевины и мочевой кислоты. Мочевина попа­дает в почву с мочой млекопитающих, а также образуется поч­венными грибами. Например, ее содержание в шампиньонах до­стигает 13% от сухой биомассы. В год на Земле образуется около 30 млн т мочевины. Это огромные ресурсы азота, так как моче­вина по химическому строению представляет собой диамид уголь­ной кислоты и содержит 47% азота. Разложение ее протекает сле­дующим путем:

(NH₂)₂CO + 2Н₂0 -» (NH₄)₂C0₂ -» 2NH₃ + С0₂+ Н₂0.

Мочевину разлагают микроорганизмы, обладающие фермен­том уреазой и широко распространенные в почве. Эти бактерии в большом числе содержатся в рубце жвачных животных, поэтому мочевину добавляют и в корма. Микроорганизмы рубца вызыва­ют ее разложение (аммонификацию) и далее переводят в белок. Более половины почвенных микроорганизмов обладают фермен­том уреазой и могут превращать мочевину в аммиак.

Она образуется как конечный продукт белкового обмена птиц, пресмыкающихся и насекомых. Экскременты змей содержат до 30% мочевой кислоты, а в гуано (преобразованном помете птиц) — 25%. Выводится из организма мочевая кислота с минимальным количеством воды или даже в твердом виде.

В моче млекопитающих концентрация мочевой кислоты нич­тожна.

Аммонификация мочевой кислоты в местах скопления гуано в аридных областях приводит к накоплению нитратов, так как образующийся аммиак окисляется нитрифицирующими бакте­риями, а при низкой влажности нитраты не вымываются. Тако­вы источники богатых залежей нитратов в Чили, Перу и Южной Африке. Гуано используется как ценное азотное и фосфорное удобрение, оно содержит около 9% азота, 13% фосфорной кис­лоты, калий и кальций.

Аммонификация хитина. Хитин — азотсодержащий полисаха­рид, полимер ацетилглюкозамина. Он содержится в клеточных стенках грибов, в панцирных покровах беспозвоночных. При его разложении образуется глюкоза (и продукты ее превращения), а также аммиак. Ферменты хитиназы особенно распространены у актиномицетов: до 98% изученных актиномицетов проявляли активность в разложении хитина. Из грибов активную роль в разложении хитина играют мукоровые, аспергиллы и др. Есть и хитинолитические миксобактерии и некоторые другие бактерии.

Аммиак, образующийся при микробном разложении вышеука­занных соединений растительного и животного происхождения, претерпевает в почве различные превращения: 1) потребляется растениями как источник азота, 2) иммобилизуется (ассимили­руется) в процессе метаболизма почвенных микроорганизмов,

3) окисляется в нитриты и нитраты. Этот последний процесс носит название нитрификации и является единственным в цикле азо­та, который ведет к образованию окисленных форм азотистых соединений из аммиака.

3 НитрификацияБиологическая природа образования в почве нитратов была установлена во второй половине XIX в. Т. Шлезингом и А. Мюнцем. Первое предположение об участии микроорганизмов в этом процессе было высказано J1. Пастером. Однако выделить микро­организмы, ответственные за процесс образования нитратов, дол­гое время никому не удавалось. С.Н. Виноградский применил для их выделения элективную среду, представляющую собой раствор чистых минеральных солей, в том числе и сернокислого аммо­ния, которым он пропитал пластинки кремнекислого геля. От­сутствие органических соединений в такой среде исключало воз­можность развития банальных гетеротрофов. В 1891 г. ему удалось выделить микроорганизмы, названные нитрификаторами. Они были представлены двумя группами, каждая из которых прово­дила один из двух этапов окисления азота: сначала образовыва­лись нитриты, а затем — нитраты.

Первую группу нитрозных (нитритных) бактерий представляют роды Nitrosomonas, Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio, вторую — нитратных бактерий — Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus. Названия родов свидетельствуют о том, что бактерии той и другой группы морфологически разнообразны — это кокки, палоч­ки, спирально изогнутые клетки. Все они — грамотрицательные бактерии, в большинстве своем очень мелкие, часто подвижные, с полярными или перитрихиальными жгутиками. Многие имеют развитые системы внутрицитоплазматических мембран. В мета­болическом отношении эти нитрифицирующие бактерии — хемолитоавтотрофы, использующие энергию окисления аммиака или азотистой кислоты для синтеза органических веществ из С0₂, т.е. осуществляющие хемосинтез.

По современным представлениям, процесс окисления аммиа­ка и нитритов локализуется на цитоплазматической мембране. Окисление аммиака до нитрата происходит ступенчато с потерей электронов. Сначала образуется гидрокисиламин, который далее окисляется до нитрита. Промежуточным продуктом может быть нитроксил:

ЫН₃+0₂ + НАДН₂ -*NH₂OH + Н₂ООН+ НАД⁺,

гидроксиламин

N₂0

т

NH₂OH —>[HNO] + 2e + 2H⁺, нитроксил

NH₂0H + 0₂ -^N0₂ + Н₂0+ Н ⁺ .

Вторая фаза нитрификации сопровождается потерей двух элект­ронов. Донором кислорода при окислении нитритов до нитрата служит вода:

N0₂ + Н₂0 - N0₃ + 2Н⁺ + 2е.

Электроны, освобождающиеся в первой и второй фазе нитри­фикации, поступают в дыхательную цепь на цитохромы. Все нит­рифицирующие бактерии — облигатные аэробы. Оптимальные условия для их роста лежат в диапазоне температур 25-30 °С и pH 7,5-8,0. В кислых почвах автотрофная нитрификация не про­исходит, этот процесс замещается окислением аммиака или дру­гих восстановленных азотсодержащих веществ до нитритов и нитратов гетеротрофными микроорганизмами — грибами и бак­териями. Это явление названо гетеротрофной нитрификацией, так как образование нитратов сопровождается параллельно иду­щим окислением органических веществ.

Широко распространенные в почвах бактерии родов Arthrobacter, Pseudomonas и другие окисляют оксимы и гидроксаматы, где гидроксиламин связан с органическими молекулами. Окис­ление может быть связано с ростом или образованием метаболи­ тов в стационарной фазе. Возможно, окисление происходит с участием активного кислорода, образующегося при разложении перекиси водорода пероксидазой. Таким образом, гетеротроф­ная нитрификация не служит источником энергии для микроор­ганизмов.

В природе гетеротрофная нитрификация осуществляется вез­де, где аммиак образуется в условиях обилия органических ве­ществ, например в компостных кучах, в скоплениях гуано (про­исхождение чилийской селитры тоже обязано, по-видимому, этому процессу), в аэротенках, в евтрофных водоемах. По масштабам гетеротрофная нитрификация, по-видимому, превышает автотрофную. Величину гетеротрофной нитрификации устанавливают, добавляя в почву ингибиторы нитрификации, которые подавля­ют только автотрофную нитрификацию и становится возмож­ным определение величины гетеротрофной нитрификации, ос­новным агентом которой являются грибы.

После того как академик Д.Н. Прянишников доказал, что ра­стения используют соединения аммония, произошла переоценка значения нитратов для питания растений. Ранее нитраты счита­лись наилучшей формой азотных удобрений для растений. Осо­бенно остро встал вопрос об азотном питании, когда стали при­менять сверхвысокие дозы нитратных удобрений. Было показано, что растения используют не более 30-50% вносимого азота нит­ратов, а остальная часть в превращенном виде закрепляется в составе органического и минерального вещества почвы, иммо­билизуется в клетках микроорганизмов, подвергается восстанов­лению до газообразных продуктов — закиси азота и N₂, вымыва­ется в грунтовые воды, откуда они выносятся в реки, моря и океаны. Объем поступлений азота с нитратами в воды составляет миллионы тонн в год. Возникла необходимость по­давления процесса нитрификации. Предложены многочисленные промышленные препараты ингибиторов нитрификации (нитропирин, АТС, N-серв и др.), синтезируемые на пиридиновой ос­нове. Применение нитропирина, например, повышает использо­вание азотных удобрений до 50-70%. Указанные препараты подавляют первую фазу автотрофной нитрификации, но не дейст­вуют на гетеротрофную нитрификацию.

Так же как и в случае с аммиаком, судьба образующихся при нитрификации продуктов неоднозначна. Нитраты претерпевают следующие превращения: 1) используются высшими растениями в процессах ассимиляции, 2) вымываются в водоемы и вызывают их евтрофизацию, 3) используются (иммобилизуются) микроорганизмами в процессе ассимиляционной нитратредукции, 4) вос­станавливаются до молекулярного азота в результате диссимиляционной нитратредукции или денитрификации.

Иммобилизация азота. Азот аммонийных и нитратных соеди­нений, поглощенных микробными клетками, включается в орга­нические полимеры и временно выводится из круговорота, так как он становится недоступным для растений. Процесс иммоби­лизации сказывается на применении удобрений: происходит сни­жение коэффициента использования азотных удобрений расте­ниями в условиях микробной конкуренции за субстрат. Доля иммобилизованного азота зависит от применяемого удобрения и почвенных условий. В случае одновременного внесения в подзо­листые почвы минеральных удобрений и соломы количество не превышает 20%. В орошаемом земледелии иммобилизация азо­та — это средство сокращения потерь азотных удобрений от вымывания. Один из приемов увеличения доли биологически зак­репленного азота — внесение молибденсодержаших удобре­ний. Так как молибден входит в активный центр ферментов азот­ного обмена— нитрогеназы и нитратредуктазы, то происходит повышение уровня органического азота в почве за счет усиления азотфиксации и ассимиляции нитратов микроорганизмами.

Процессы микробиологического закрепления азота следует учитывать при выборе способов обработки почвы, противоэрозионных мероприятий и при внесении удобрений. Например, запашка соломы под зерновые перед посевом закрепляет азот и вызывает азотное голодание растений; внесение соломы осенью удерживает азот от вымывания; солома, внесенная под бобовые, всегда дает положительный эффект.

Иммобилизованный азот — наиболее лабильная часть органи­ческого азота почвы. Этот азот минерализуется в почве в первую очередь и является ближайшим резервом в питании растений. Часть иммобилизованного азота удобрений включается во фракции поч­венного гумуса, устойчивые к разложению. Микробные клетки выедаются простейшими и происходит реутилизация азота. Через микробные клетки в почве проходит поток азота, в 2-3 раза пре­вышающий ежегодный вынос азота с урожаем; 10-30% азота мик­робной биомассы поступает в растения. В почвах Нечерноземной зоны России максимально возможные величины потока азота че­рез микробную биомассу определяются в 250 кг/га за сезон.

4 ДенитрификацияТермином «денитрификация» обозначают сумму процессов, ко­торые ведут к частичному или полному восстановлению нитратов до нитритов и затем газообразных форм азота NO, N₂0, N₂. Разли­чают ассимиляционную и диссимиляционную денитрификацию. В узком смысле термина под денитрификацией понимают только диссимиляционное восстановление окисленных форм азота.

Ассимиляционные процессы восстановления нитратов до NH₄, которые приводят к синтезу азотсодержащих клеточных компо­нентов, свойственны всем растениям и многим микроорганиз­мам, которые могут расти на средах с нитратами. Они проходят в аэробных и анаэробных условиях. Этот путь преобразования нит­ратов называется ассимиляционной нитратредукцией в отличие от диссимиляционной нитратредукции, или денитрификации, которая представляет собой процесс, в анаэробных условиях обеспечивающий микроорганизмы энергией, но с потерей вос­становленных соединений азота или молекулярного азота.

Денитрификация протекает в анаэробных условиях и подав­ляется кислородом. Нитраты в анаэробных условиях выполняют функцию акцепторов электронов, поступающих с окисляемого субстрата, которым может быть как органическое, так и неорга­ническое вещество. В первом случае процесс проводят хемоорганотрофы, во втором — хемолитотрофы. Ферменты диссимиляционной нитратредукции — это нитратредуктазы, содержащие MoFeS-белки. Они локализованы на клеточных мембранах. Ко­нечные продукты денитрификации выделяются из клетки в газо­образной форме в виде NO, N₂0 или N₂ в зависимости от вида микроорганизма и от условий среды. Нитраты восстанавливают­ся в следующей последовательности:

N0₃– NO₂ — NO — N₂0 — N₂.

Энергетический выход при переносе электронов к N0₂~ и N₂0 приблизительно одинаков и в сумме составляет около 70% энер­гетического выхода при дыхании с участием свободного кисло­рода. Поэтому процесс денитрификации иначе называют ана­эробным нитратным дыханием.

Число родов бактерий, представители которых способны к нитратному дыханию, весьма велико. При этом первый этап — переход нитратов в нитриты — способны осуществлять разнооб­разные микроорганизмы, в том числе и эукариоты — водоросли, грибы и дрожжи. Полную денитрификацию до молекулярного азота проводят только прокариоты. Большинство из них — фа­культативно анаэробные хемоорганотрофы многих родов, исполь­зующие нитраты как окислители органических субстратов. При этом последние окисляются до С0₂ и Н₂0, как и в акте кисло­родного дыхания, а азот теряется в газообразных формах:

Органическое вещество + KN0₃ -» С0₂ + Н₂0+ N₂.

Представители хемолитототрофных бактерий-денитрификаторов — Thiobacillus denitriflcans, Thiomicrospira denitrificans, Paracoccus denitrificans. Нитраты для них выступают в качестве окислителей неорганических веществ, например серы, Н₂ или тиосульфата, восстанавливаясь при этом либо полностью до N₂, либо только до нитритов (у Thiobacillus thioparus).

Все денитрифицирующие бактерии — факультативные ана­эробы, осуществляющие восстановление нитратов только в от­сутствие свободного кислорода. В аэробной обстановке они мо­гут переключаться на дыхание для получения энергии, а нитраты использовать в процессах ассимиляционной нитратредукции как источники азота. Помимо этого, многие или даже все денитрификаторы, как показали исследования последних лет, обладают способностью к азотфиксации. Все ферменты азотного цикла (нитрогеназа азотфиксаторов, нитритоксидоредуктаза нитрификаторов, ассимиляторная и диссимиляторная нитратредуктазы) имеют низкомолекулярный молибденсодержащий кофактор, который может быть передан от одного фермента к другому.

Ферменты ассимиляционной и диссимиляционной нитратре­дукции имеют большое сходство, но при диссимиляционном процессе в анаэробных условиях фермент погружается в мембра­ну, и его работа по восстановлению нитратов обеспечивает энер­гетический процесс получения клеткой АТФ. Изучение извест­ного азотфиксатора Azospirillum lipoferum показало, что при наличии нитратов в анаэробных условиях этот микроорганизм проводит денитрификацию, а в аэробных — ассимилирует нитрат. В опре­деленных условиях процессы азотфиксации и нитратредукции могут идти в клетке параллельно.

Таким образом, процессы ассимиляционной и диссимиляци­онной нитратредукции, азотфиксации и денитрификации взаимно связаны и могут осуществляться одними и теми же бактериями. Направление процессов будет зависеть от конкретных условий.

В процессе диссимиляционной нитратредукции помимо мо­лекулярного азота могут образовываться другие газообразные продукты — NO, N₂0 и NH₃.

Особенно остро стоит проблема образования и стока закиси азота, так как с ней связывают некоторые природные и климати­ческие явления — разрушение озонового слоя в стратосфере, не­которые фотохимические реакции. Один из самых мощных ис­точников N₂0— микробная денитрификация.

Закись азота, как, по-видимому, и окись, относится к обяза­тельным продуктам денитрификации, что было доказано с ис­пользованием ацетилена как ингибитора восстановления N₂0 в N₂. Добавление ацетилена к почвенной системе приводит к на­коплению закиси азота в среде. N₂0 образуется также в первой фазе нитрификации в условиях лимита кислорода и диссимиля- ционного восстановления нитрата в аммоний. Сопряжение мно­гих микробиологических процессов через N₂0 при противопо­ложном влиянии ряда внешних факторов на ее образование и удаление может обеспечить фильтр для выхода закиси азота из почвы в атмосферу (см. рис. 83). Один из путей удаления закиси азота в аэробных условиях — неспецифический процесс, прово­димый комплексом микроорганизмов, образующих перекись во­дорода и каталазу. Разложение перекиси водорода каталазой в окислительных условиях приводит к образованию из N₂0 окиси азота и N0₂". К реакциям такого типа, по-видимому, способны многие почвенные микроорганизмы, и процесс зависит не от агента реакции, а от экологических условий. В анаэробных усло­виях N₂0 может служить субстратом нитрогеназы — фермента азотфиксации, который восстанавливает ее до N₂ или аммиака. Итак, денитрификация в современном понимании — это один из путей биологического восстановления нитратов. Процесс ха­рактеризуется тем, что он имеет энергетическое значение для микроорганизмов, протекает в анаэробных условиях и приводит к образованию газообразных форм азота в виде NO, N₂0 и N₂. До молекулярного азота осуществляют его только прокариоты — представители многих таксономических, физиологических и эко­логических групп.

В природе денитрификация имеет широкие масштабы. В ре­зультате в атмосферу ежегодно поступает 270-330 млн т N₂, т.е. этот процесс сравним с азотфиксацией. Большая часть этого азо­та — потери из почвы. Особенно велики они в переувлажненных почвах, при внесении нитратов вместе с навозом и другими орга­ническими удобрениями. Активно протекает денитрификация в ризосфере растений за счет постоянного поступления органи­ческих веществ в форме корневых выделений.

Зависимость денитрификации в прикорневой зоне от концент­рации углеродсодержащих соединений четко проявляется в на­личии сезонной динамики, совпадающей с динамикой развития растений.

На интенсивность денитрификации сильно влияет аэрация почвы и pH. Усиление аэрации и кислая среда снижают скорость денитрификации и повышают соотношение N₂0/N₂b конечных продуктах. Разнонаправленные процессы денитрификации и нит­рификации в сухих бесструктурных почвах обычно протекают последовательно: при увлажнении — денитрификация, при ис­сушении — нитрификация. Чередование этих процессов ведет к быстрой потере азота почвой.

В структурных почвах оба процесса идут одновременно, но в пространственно разделенных микрозонах с разным окислительно-­восстановительным потенциалом. Так же совершаются процессы в зоне корневых систем, где имеется градиент концентрации кисло­рода и органические вещества, что стимулирует денитрификацию.

Денитрификация — одна из основных причин неполного ис­пользования растениями вносимых в почву азотных удобрений. Уменьшения потерь азота можно добиться путем применения гранулированных удобрений, слаборастворимых азот­ных туков и дробным внесением удобрений. Регулировать этот процесс также можно путем создания определенного водного режима почв, меняя таким образом аэрацию. Предложены и хи­мические ингибиторы денитрификации, но это фактически ве­дет к уничтожению большинства почвенных бактерий и не под­держивается почвенными микробиологами.

Иногда ставится вопрос, является ли денитрификация поло­жительным или отрицательным процессом. Для сельского хозяй­ства — это азотные потери, а для природы в целом — это оздоро­вительный процесс, так как именно в результате денитрификации происходит предохранение фунтовых вод и водоемов от чрезмер­ного накопления в них нитратов, вымываемых из почв. С пози­ции конечных продуктов ассимиляционное восстановление нит­ратов в аммоний — более желательный процесс, чем образование N₂ и N₂0, однако, в природе не всегда происходит то, что нужно человеку. Задача науки — вскрыть механизмы природных процес­сов и научиться их регулировать, чтобы направлять в нужную сто­рону. Денитрификация имеет положительное значение при очистке сточных вод, содержащих большие количества связанного азота, которые не должны поступать в реки и озера.

Контрольные вопросы:

1. Круговорот азота в биосфере?

2. Роль и участие азота в биологическом круговороте веществ?

3. Нитрификация и ее значение?

4. Процесс аммонификация?

5. Денитрификация и ее роль в природе?

6. Представители хемолитототрофных бактерий-денитрификаторов?

7. С помощю каких микроорганизмов проходит разложение азотистых веществ?

Литература:

17. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв: Учебник. - 3-е изд., испр. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 2005.

18. Звягинцев Д.Г. Микроорганизмы и почва. М.: МГУ, 1987.

19. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ, 1989. с.336.

20. Мирчинк Т.Г.Почвенная микология .-М.: Изд. МГУ,1986.

7. Емцов В. Т.Микробы, почва, урожай. – М.: Изд. Колос,1980.

8. Илялетдинов А.Н.Микробиологические превращения азотосодержащих соединений в почве. Алма – Ата, 1976.

9. Почвенная микробиология./ Под ред. Д.И. Никитина /- М.: Изд. Колос,1979.

Лекция 12

Круговорот серы

Цель лекции:ознакомить с круговорот серы в биосфере и раскрыть роль серобактерий в повышении плодородия почвы

Ключевые слова: круговорот серы, серобактерии, органические вещество, восстановление и окисление серы

Вопросы:

1. Серобактерии
2. Физиологические исследования серобактерий

1 Серобактерии Сера — биогенный элемент, необходимый для жизни. В бел­ках сера содержится в форме некоторых аминокислот (цистин, цистеин), входит в молекулы витаминов, коферментов, присутст­вует в растительных эфирных маслах. В растениях содержание серы колеблется от 0,2 до 1,8%, в организме человека — около 0,4%. Соединения серы в живой клетке участвуют в важных ме­таболических процессах (например, она входит в состав фермен­тов нитрогеназы и нитратредуктазы, ответственных за превраще­ния азота — его фиксацию и восстановление).

С урожаем из почв ежегодно выносится от 10 до 80 кг/га серы в зависимости от биологических особенностей сельскохозяйствен­ных растений и величины урожая. Так называемые безбалластные минеральные удобрения не содержат серы, и дефицит ее в почве с ростом урожаев постоянно увеличивается. Поэтому не­обходимы изучение серного режима почв, разработка методов диагностики дефицита серы и эффективного применения серо­содержащих удобрений. В почвах сера претерпевает разнообраз­ные превращения, переходя из неорганических соединений в органические и обратно. В почве в виде неорганических соедине­ний сера бывает окисленной (сульфаты, политионаты), восста­новленной (сульфиды) и редко молекулярной. При разложении остатков животных, растений и микроорганизмов освобождают­ся серосодержащие аминокислоты, тиоспирты, тиофенолы, тиоэфиры, гетероциклические соединения (например, тиофен), в которых сера находится в восстановленном состоянии. В орга­нических веществах сера обычно содержится в восстановленном состоянии в виде SH-групп. Есть органические соединения, со­держащие серу в окисленной форме. Это сульфиновые и суль­фокислоты и их соли, применяемые в моющих средствах как поверхностно-активные вещества (ПАВ), но это неприродные соединения. Они могут попадать в почву со сточными водами.

Цикл превращений серы сходен с циклом азота: он включает окислительные и восстановительные звенья, а также превраще­ние серы без изменения ее валентности. В этих превра­щениях участвует много разнообразных групп микроорганизмов: аэробных и анаэробных, хемо- и фототрофов, истинных бакте­рий и архебактерий. В последние десятилетия было сделано мно­го открытий в микробиологии цикла серы в связи с изучением архебактерий. Некоторые из них оказались активными участника­ми превращения соединений серы, способными осуществлять неизвестные ранее процессы.

Рассмотрим цикл серы, объединив в отдельные звенья процессы окислительного характера, восстановительные и процессы освобождения серы при разложении органических веществ. Окисление серы и ее восстановленных неорганических и органических соединений происходит в аэробных и анаэробных условиях с участием разных групп микроорганизмов. В аэробных условиях окислительные процессы осуществляют хемоавтотрофные прока­риоты — серные бесцветные (неокрашенные) бактерии и тионо­вые бактерии, термоацидофильные архебактерии, а также некото­рые типичные гетеротрофные бактерии. В анаэробных процессах участвуют фототрофные серные пурпурные и зеленые бактерии, осуществляющие бескислородный фотосинтез.

Бесцветные серобактерии по строению сходны с цианобакте­риями. Основное их отличие от последних — отсутствие пигмен­та. По морфологии среди них различают одноклеточ­ные: крупные подвижные (Thiovulum) и неподвижные (Achromatium) бактерии; виды с мелкими спиралевидными или другой формы клетками (Thiospira, Thiobacterium); нитчатые многоклеточные неподвижные (Thiothrix) и скользящие бактерии (Beggiatoa, Thioploca). Общим признаком всех организмов этой группы слу­жит способность откладывать внутриклеточно образующуюся при окислении H₂S молекулярную серу. Механизм этого процесса и его физиологический смысл, возможно, различен у разных пред­ставителей и до конца еще не ясен.

С.Н. Виноградский впервые предположил возможность исполь­зования микроорганизмами энергии окисления неорганических соединений для синтеза органических веществ из С0₂ — хемо­синтеза. Четкие доказательства наличия хемосинтеза в чистых культурах бесцветных серобактерий были получены только в пос­леднее время, например у Beggiatoa. В то же время известны слу­чаи окисления сероводорода в результате гетеротрофной жизни некоторых бактерий из группы бесцветных серных за счет обра­зования ими перекиси водорода при дыхании. Физиологический смысл этого процесса заключается в детоксикации среды путем разложения образующегося токсичного продукта метаболизма Н₂0₂ с участием сульфидов, которые окисляются до молекуляр­ной серы.

Фотосинтезирующие серные бактерии в отличие от бесцвет­ных анаэробы. Наличие в их клетках пигментов бактериохлорофиллов придает им красную или зеленую окраску, поэтому их делят соответственно на пурпурные (пор. RhodospiriHales) и зеле­ные (пор. Chlorobiales). Все они осуществляют на свету бескислородный фотосинтез, используя восстановленные соединения серы в качестве доноров электрона в анаэробных условиях.

Пурпурные серобактерии — грамотрицательные одноклеточ­ные прокариоты разной формы и размеров, подвижные и непод­вижные. В клетках существует хорошо развитая система мембран — тилакоидов (внутрицитоплазматические раз­растания мембраны), у некоторых есть газовые вакуоли. Окисляя H₂S внутриклеточно, они временно откладывают в клетках моле­кулярную серу в виде капель, ограниченных белковой мембра­ной, а при дефиците сероводорода окисляют серу далее до сер­ной кислоты. Представители: Thiospirillum и Chromatium — крупные подвижные бактерии; Thiodictyon, Thiocapsa— неподвижные, без жгутиков.

Зеленые серобактерии тоже одноклеточные, разной морфоло­гии — от простых палочек до звездчатых клеток с простеками (нитевидные выросты клеток). Некоторые образуют цепочки или сетчатые структуры. Пигменты локализованы в хлоросомах. Зе­леные серобактерии — более строгие анаэробы, чем пурпурные. Серу в клетках не накапливают, а выделяют ее наружу. Для боль­шинства зеленых серобактерий установлена способность к азот­фиксации. Помимо одноклеточных зеленых серобактерий — Chlorobium, Prosthecochloris и других — известны представители зеленых скользящих бактерий с нитчатым строением (Chloronema), которые тоже способны к окислению H₂S (см. рис. 85). Встреча­ются в почвах рисовых полей и в болотах. Для их развития нужен свет и анаэробные условия.

• ⇐ Назад
• 14
• 15
• 16
• 17
• 18
• 19
• 202122
• 23
• 24
• 25
• 26
• 27
• 28
• 29
• Далее ⇒