Биохимические признаки коринебактерий.
План
1.Таксономия возбудителей дифтерии.
2. Морфология и биологические свойства.
Культивирование. Токсинообразование.
3. Источники инфекции. Механизм заражения.
Патогенез, клинические формы дифтерии.
4. Особенности иммунитета. Профилактика дифтерии.
Дифтерия.
Таксономия возбудителя дифтерии.
Возбудитель дифтерии – Corynebacterium diphtheriaе (coryna– булава, bacterium –палочка,diphthera – пленка) относится к роду Corynebacterium семейству Corynebacteriасeae,отделу Firmicutes.Открыл коринебактерии дифтерии Э. Клебс в 1883 г., а выделил в чистой культуре
Ф. Леффлер в 1884 г. (палочка Клебса – Леффлера).
Кроме патогенных для человека и животных вида С. diphtheriaе в род Corynebacteriumвходят:
1) коринебактерии, патогенные для растений;
2) непатогенные коринебактерии:
а) дифтероиды – С. xerosis, C. ulcerans, C. pseudotuberculosis;
б) псевдодифтерийные (ложнодифтерийные, палочки Гоффмана) –
С. рseudodiphtheriticum (C. hoffmfni).
Биологические особенности возбудителя дифтерии, имеющие лабораторно-диагностическое значение.
Морфология.
Коринебактерии дифтерии представляют собой прямые, или слегка изогнутые, полиморфные палочки размером 1-8мкм в длину и 0,3 – 0,8 мкм в ширину, имеющие булавовидные утолщения на обоих концах или по ходу длины палочки (зерна Бабеша – Эрнста), т.е. зерна волютина.
При окраске по Леффлеру (щелочным метиленовым синим в течение 10 мин.) эти полюсные включения окрашиваются в фиолетовый (темно-синий) цвет, а цитоплазма палочек – в голубой.
При окраске мазков по Нейссеру– зерна Бабеша-Эрнста окрашиваются в коричневый, черный или темно-синий цвет, а цитоплазма палочек – в желтый цвет; при окраске пиоктонином включения окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, а цитоплазма палочек – в светло- фиолетовый цвет.
По Граму коринебактерии равномерно окрашиваются в фиолетовый цвет, т.е. грам +.
Спор и капсул не образуют, неподвижны. Благодаря разламывающему механизму деления их клетки в мазке располагаются под угломи образуют букву игрек, или римские V – Х, или принимают вид растопыренных пальцев.
Полиморфизм их проявляется в появлении ветвистых, нитевидных форм, кокковидных и дрожжеподобных образований.
В отличие от истинных палочек Леффлера дифтероидыи ложнодифтерийные палочки Гоффмана в мазках располагаются в виде частокола, а зерна волютина имеют на одном конце или совсем не имеют.
Культуральные свойства.
Коринебактерии дифтерии – факультативные анаэробы или аэробы; optim. t° = 370C, границы роста 15° – 400С; рН среды 7,2 – 7,6. Они не растут на обычных питательных средах. Культивируют их на средах, содержащих кровь или сыворотки, а также теллурит калия.
На основании культуральных и ферментативных свойств С. diphthemae подразделяются на 3 биовара: gravis, mitis, intermedius.
Первичные посевы материала при выделении коринебактерий дифтерии производят на пластинчатые элективные среды (в чашках Петри): кровяно-теллуритовый агар - КТА, среда Клауберга; сывороточный агар с теллуритом калия и цистином – «Т», среда Тинсдаля – Садыковой; кровяной агар 5 – 10%; 20% сывороточный агар,а также на дифференциально-диагностическую среду Бучина.
На этих средах С. diphtheriaе образуют колонии в зависимости от биовара;на среде Клауберга(через 24-48 часов):
var gravis - (грубый, шероховатый) формирует плотные сухие шероховатые (R – формы), розеткообразные колонии диаметром 1,5 – 2 мм, с волнистым краем серого или темно-серого (черного) цвета. Колонии хрупкие – при раздавливании петлей они крошатся на мелкие кусочки. Их можно также «двигать» петлей по поверхности агара без нарушения целостности. На средах с кровью не дают гемолиза.
var mitis(тонкий, гладкий)- образует серые матовые колонии диаметром 1,5 – 2 мм с ровным краем и гладкой поверхностью , блестящие (S – формы). Характерна вариабельность размеров колоний. Обычно на кровяном агаре имеют небольшую зону гемолиза.
var intermedius,(промежуточный) –образует колонии RS – формы: мелкие, серые, прозрачные колонии диаметром 0,5 – 1 мм.
На среде Тинсдалявокруг колоний всех биоваров образуется темно-коричневый ободок.
Кроме элективных сред первичные посевы материала можно производить на дифференциально-диагностическую среду Бучина(хинозольная среда). На ней колонии С. diphthemae приобретают фиолетовый цвет вследствие восстановления индикатора, т.е. как цвет среды. А дифтероиды и палочки Гоффманаобразуют колонии бесцветные или голубоватыена фиолетовом фоне среды.
На сывороточном и сахарном бульонах биовар gravisобразует пленку и зернистый осадок;биовар mitis – диффузное помутнение;биоварin termedius, - муть и зернистый осадок.
Чистую культуру коринебактерий выделяют на скошенных элективных средах Ру(свернутая лошадиная сыворотка) и Леффера(3 части бычьей сыворотки и 1 часть сахарного бульона), которые выглядят одинаково – косячки белого цвета. Можно использовать также и скошенный 20% сывороточный агар.
На средах Ру (Леффера)коринебактерии дифтерии через 8 – 14 часов вырастают в виде изолированных небольших (точечных) выпуклых желтовато-коричневых колоний с гладкой или слегка зернистой поверхностью, напоминающих «шагреневую кожу».
Ложнодифтерийные бактерии культивируются на всех средах, в том числе и на СПА, где образуют сухие мелкие колонии серого цвета, а на бульонах вызывают помутнение.
Ферментативные свойства.
Коринебактерии дифтерии всех 3-х биоваров не свертывают молоко, не разлагают мочевину, не образуют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитраты, восстанавливают теллурит калия в сульфид теллурита, вследствие чего на среде Клауберга их колонии становятся серыми или черными; все обладают ферментом цистиназой,чтоиспользуется для дифференциации от непатогенных коринебактерий.
Все 3 биовара на обычном коротком «пестром» ряде Гисса ферментируют до кислоты глюкозуимальтозу,но не ферментируют лактозу, маннит и сахарозу.
Однако для изучения ферментативных свойств коринебактерий используют жидкие среды(но без поплавков, т.к. ферментация проходит с образованием кислоты) и другой состав короткого пестрого ряда Гисса: сахароза, глюкоза, крахмал и мочевина.
Сахароза, глюкоза и крахмалдо посева имеют светло-желтый цвет, при ферментации до кислоты цвет меняется нарозовый. Мочевинадо посева темно-желтого цвета,при расщеплении цвет меняется на ярко красный (малиновый).
Все три биовара ферментируют глюкозу,а var gravis,расщепляет и крахмал,что является дифференциальным признаком.
Биохимические признаки коринебактерий.