Стерилизация питательных сред
Обеспечение асептики производства
В самом общем виде биотехнологический процесс представляет собой превращение субстрата в продукт при участии биологических агентов. Предметом рассмотрения экологической биотехнологии являются такие процессы, в которых:
– субстрат является отходом производства, из которого можно получить ценные продукты (сульфитный щелок, молочная сыворотка, послеспиртовая и ацетонобутиловая барда, отходы растениеводства и животноводства и т. д.);
– субстрат является загрязняющим веществом, уже попавшим в окружающую среду (нефтяные разливы при транспортировке, пестициды, бытовые отходы);
– продуктами являются нетоксичные, поддающиеся деградации в природных условиях соединения, которые могут явиться альтернативой химически синтезированным (биопестициды);
– биологические агенты – штаммы микроорганизмов, выделенные из специфических мест обитания, адаптированные к высоким концентрациям токсичных соединений либо полученные методами генетической рекомбинации или генной инженерии. Они способны с высокой эффективностью осуществлять деструкцию ксенобиотиков и поллютантов.
Подавляющее большинство продуктов микробного синтеза получают культивированием микроорганизмов в асептических условиях, т. е. когда в ферментационной среде отсутствуют жизнеспособные микроорганизмы (вегетативные клетки, споры), кроме производственного штамма − продуцента целевого метаболита. В связи с этим в асептических биотехнологических производствах обязательными и весьма ответственными являются технологические операции по стерилизации питательных сред, воздуха, оборудования и коммуникаций.
Стерилизация питательных сред
Известен ряд способов стерилизации питательных сред: термической обработкой, ультразвуком, ультрафиолетовым светом, гамма-излучением, потоком ускоренных электронов, ультрафильтрацией, токами сверхвысокой частоты, химическими агентами. Выбор способа стерилизации определяется экономическими факторами (затратами на стерилизацию), лабильностью компонентов питательной среды, сложностью аппаратурного оформления процесса, уровнем микробной загрязненности исходной среды. В производственной практике доминирует термическая стерилизация сред, но большие затраты энергии на процесс и высокая термолабильность компонентов питательных сред все чаще обусловливает применение методов «холодной» стерилизации (ультрафильтрация, ионизирующее излучение).
Микроорганизмы сильно различаются по устойчивости к воздействию высоких температур. Вегетативные клетки быстро погибают при температуре 70−100°С, споры бактерий могут выдерживать температуру 120°С в течение нескольких десятков минут. Высокая термическая устойчивость особенно характерна для бактерий рода Bacillus. В связи с этим расчет режимов стерилизации питательных сред и оборудования производят по скорости отмирания спор наиболее термически устойчивого штамма Bacillus stearothermophilus-1518.
Отмирание клеток (спор) микроорганизмов под воздействием высокой температуры описывается уравнением
где N − число живых клеток в объеме стерилизационной среды ко времени τ;
− скорость отмирания в данный момент времени;
k − константа скорости отмирания клеток, показывающая, какая часть клеток, выживших ко времени τ, отмирает за секунду (отрицательный знак свидетельствует об убыли живых клеток), с−1.
При изотермических условиях стерилизации k = const и в результате интегрирования уравнения получают выражение для расчета времени стерилизации:
где No − уровень микробной загрязненности исходной среды (число клеток и спор в 1 мл среды).
Из формулы следует, что если N → 0, то τ → ∞, поэтому в расчетах условно принимают уровень нестерильности N = 0,01 (из ста операций по стерилизации среды одна нестерильна).
Расчет констант гибели спор Bacillus stearothermophilus-1518 показал, что с повышением температуры стерилизации константа стремительно растет. Например, при повышении температуры со 120 до 130°С константа отмирания возрастает на порядок. Рост константы гибели спор значительно опережает рост констант реакций разложения термолабильных компонентов питательных сред (витаминов, аминокислот, углеводов и др.). Следовательно, для максимального сохранения полезных компонентов среды стерилизацию необходимо проводить при высоких температурах и коротком времени термообработки. В производственных условиях чаще всего используют температурный режим 120−135°С при продолжительности термообработки среды в установке непрерывной стерилизации (УНС) 10−30 мин. Стерилизация при температуре более 140°С экономически нецелесообразна из-за возрастающих затрат на оборудование, теплоноситель и охлаждающую воду.
Применяют два метода стерилизации: периодический и непрерывный. Периодическим методом стерилизуют небольшие объемы питательных сред (до 10 м3) непосредственно в ферментаторах. Этот метод широко используют при накоплении чистой культуры в инокуляторах и посевных аппаратах, когда востребовано главное достоинство метода − высокая надежность стерилизации. Из-за длительности процессов нагрева и охлаждения среды, приводящих к ухудшению ее качества, периодический метод непригоден для стерилизации больших объемов сред. В этом случае применяют непрерывную стерилизацию в специальной установке (УНС), основными элементами которой являются нагреватель, выдерживатель и теплообменник для охлаждения среды (рис. 41). Компоненты среды смешивают в емкости, обогреваемой глухим паром, при температуре 80−85°С, ускоряющей растворение веществ в воде. Необходимое условие успешной стерилизации − тщательная гомогенизация среды: в крупных частицах из-за медленного прогрева могут сохраниться споры, способные инфицировать культуральную жидкость. Такие частицы задерживаются фильтром.
Рис. 41. Установка непрерывной стерилизации питательной среды:
1 – емкость для приготовления среды; 2 – сетчатый фильтр;
3 – перфорированный цилиндр нагревателя; 4 – нагреватель;
5 – выдерживатель; 6 – регулятор давления; 7 – холодильник
Нагреватель предназначен для быстрого (в течение нескольких секунд) непрерывного нагревания среды до температуры стерилизации путем прямого смешения с острым паром.
Выдерживатель трубчатого типа (диаметр труб 0,4−0,6 м) обеспечивает движение среды в режиме идеального вытеснения и пребывание ее при температуре стерилизации в течение заданного времени. Общая длина труб выдерживателя определяется временем стерилизации среды.
Главное требование к теплообменнику для охлаждения среды − герметичность, гарантирующая сохранение стерильности. Этому требованию в наибольшей степени соответствует теплообменник типа «труба в трубе», имеющий минимальное количество разъемных соединений, являющихся потенциальными точками проникновения инфекции. Сохранение стерильности настолько важно, что серьезные недостатки трубчатого теплообменника: низкий коэффициент теплопередачи, громоздкость при малой пропускной способности – в расчет не принимаются.
Типовые конструкции УНС рассчитаны на производительность по стерильной среде 5, 10, 20, 50, 100 и 300 м3/ч. Стерилизацию среды осуществляют непосредственно при загрузке ее в ферментатор. Производительность установки выбирают такой, чтобы продолжительность загрузки ферментатора не превышала часа.
Термообработка сложных по составу сред может привести в некоторых случаях к взаимодействию компонентов (например, аминокислот с углеводами) с образованием продуктов (в данном примере меланоидинов), не ассимилируемых микроорганизмами и даже ингибирующих их рост. В этом случае растворы взаимодействующих компонентов готовят в отдельных емкостях и стерилизуют их поочередно.
Следует отметить, что жиры, масла и синтетические поверхностно-активные вещества, используемые в составе питательных сред в качестве пеногасителей, обволакивают споры и клетки микроорганизмов и повышают их термостабильность в 2−3 раза. Учитывая это обстоятельство, пеногасители не вводят в состав исходной среды, а стерилизуют в отдельном аппарате (бачке), обогреваемом глухим паром, в жестких условиях: при температуре 140°С в течение 1,5−2,0 ч. Охлажденный стерильный пеногаситель хранят под давлением стерильного воздуха и при необходимости передают непосредственно в ферментатор.