Определение специфичности лактатдегидрогеназы

 

Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует превращение пирувата в лактат на последней стадии гликолиза:

  О       О      
  //       //      
  С¾ОН   + ЛДГ С¾ОН   +  
  ½ + НАДН + Н ¾¾¾¾> ½ +   НАД  
  С = О       Н¾С¾ОН      
  ½       ½      
  СН3       СН3      

пируват лактат

 

Принцип метода. В ходе реакции кофермент НАДН + Н+ окисляется до НАД+ и поглощение при 340 нм, характерное для НАДН + Н+, уменьшается. Учитывая коэффициент молярной экстинкции НАДН, равный при 340 нм 6,22×10–3, рассчитывают скорости ферментативной реакции в микромолях/мин. Для проверки специфичности ЛДГ можно вместо пирувата использовать другую кетокислоту –оксалоацетат или a–кетоглутарат.

Ход работы. В кювету спектрофотометра помещают 1 мл раствора пирувата; 1,7 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,5); 0,2 мл раствора НАДН + Н+ и 0,1 мл раствора ЛДГ (или 0,1 мл сыворотки) и измеряют поглощение при 340 нм с интервалом 1 мин в течение 10 минут.

Отдельно измеряют поглощение в пробе, содержащей вместо ЛДГ 0,1 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,5 (контрольная проба). Количество образовавшегося НАД+ рассчитывают по разнице между величиной поглощения в контрольной пробе при 340 нм и величиной поглощения в каждый момент времени протекания реакции.

Рассчитывают скорость реакции в микромолях/мин и строят график зависимости скорости реакций от времени, находят начальную скорость ферментной реакции.

Аналогично проводят определение с раствором оксалоацетата и делают вывод о специфичности действия ЛДГ.

Материалы и реактивы: фосфатный буфер, рН 7,5 (см. Приложение В, п.2); раствор ЛДГ в 0,1 М фосфатном буфере, (рН 7,5), 5 мкг в 1мл, или сыворотка как источник ЛДГ; раствор НАДН в 0,1 М фосфатном буфере, 2 мг/мл; раствор пирувата или оксалоацетата 10–3 М в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5.

 

Флавиновые дегидрогеназы

Кофакторами для них являются флавинадениндинуклеотид (ФАД) или флавинмононуклеотид (ФМН). Эти кофакторы являются производными рибофлавина (витамина В2).

    О
    || NН2
(ОНСН)3 ¾ CН2 ¾О ¾ (Р)   (НСОН)3 - CН2 ¾О-Р ¾ ОН ½
½   ½ ½ С
2   2 О / \\
½   ½ ½ N ¾С N
СН N N   СН N N НО ¾Р=О // || ½
// \ / \ // \   // \ / \ // \ ½ Н¾С С С¾Н
Н3С ¾С С С С = О   Н3С ¾С С С С = О О \ / \ //
½ | | ½ ½   ½ | | ½ ½ ½ N N
Н3С ¾С С С N ¾Н   Н3С ¾С С С N ¾Н Н2С О
\\ / \ // \ /   \\ / \ // \ /
С NС   С NС Н Н
½ ||   ½ || Н ½ ½ Н
Н О   Н О НО ОН
     
ФМН   ФАД

Флавиновые кофакторы прочно связаны с апоферментом, следовательно, являются простетической группой.

В ходе реакции отщепляемые от субстрата атомы водорода присоединяются к изоаллоксазиновой группировке кофактора:

Н R   Н R Н
½ ½   ½ ½ ½
С N N   С N N
// \ / \ // \   // \ / \ / \
Н3С ¾С С С С = О   Н3С ¾С С С С = О
2 + ½ | | ½ ½   ½ | | ½½ ½ + S
Н3С ¾С С С N ¾Н   Н3С ¾С С С N ¾Н
\\ / \ // \ /   \\ / \ / \ /
С N С   С NС
½ ||   ½ ½ ||
Н О   Н Н О
     
ФАД (или ФМН)   ФАДН2(или ФМН2)

окисленная форма восстановленная форма

 

Флавиновые ферменты по типу катализируемой реакции делятся на две группы: первая группа - это ферменты, которые передают водород или электрон промежуточным соединениям, и вторая группа (оксидазы) - которые могут передавать отнятый водород кислороду воздуха.

К первой группе относятся флавопротеины: пируватдегидрогеназа, дегидрогеназа Д - аминокислот (1.4.99.1), сукцинатдегидрогеназа и др.

Ко второй группе - ксантиноксидаза (1.2.3.2.), пируватоксидаза (1.2.3.3.), глюкозооксидаза и др. ферменты.