И пероксидазы по Михлину и Броневицкой

Принцип метода определения активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы основан на вторичном окислении аскорбиновой кислоты хинонами, образующимися из пирокатехина под действием ферментов. Избыток неокисленной кислоты оттитровывают йодом:

Н ½       Н ½  
С // \       С // \  
Н¾ С С ¾ ОН ½ || + 1/2 О 2 полифенолоксидаза ¾¾¾¾¾¾¾¾> Н¾ С С = О ½ | + Н2О  
Н¾ С С ¾ ОН \\/ С   Н¾ С С = О \\/ С  
½ Н       ½ Н  
пирокатехин       о-хинон  
О= С ¾¾ Н   Н   О= С ¾¾
½ ½   ½   ½
НО¾С С   С   О = С
|| О //\   //\   ½ О
НО¾С + Н¾ С С = О   Н¾ С С¾ ОН   О = С
½ ½ ½ ¾¾> ½ || + ½
Н¾С¾¾ Н¾ С С = О   Н¾ С С ¾ ОН   Н ¾ С ¾¾
½ \\ /   \\ /   ½
НО¾С¾Н С   С   НО¾С¾Н
½ ½   ½   ½
СН2ОН Н   Н   СН2ОН
аскорбиновая о - хинон пирокатехин дегидроаскорбиновая кислота кислота
           
           
О=С ¾¾       О= С ¾¾  
½       ½  
НО¾С       НО¾С¾ J  
|| О       ½ О  
НО¾С + J2 ¾¾>   НО¾С¾ J  
½       ½  
Н¾С¾¾       Н¾С¾¾  
½       ½  
НО¾С¾Н       НО¾С¾Н  
½       ½  
СН2ОН       СН2ОН  
неокисленная a,b дииод- аскорбиновая кислота аскорбиновая кислота  
                             

Ход работы. Получение ферментной вытяжки.

3 г. испытуемого материала растирают в ступке с 20 мл 0,3 М ацетатного буфера с рН 4,7, переносят в колбу и оставляют на 30 минут для настаивания при комнатной температуре. После настаивания вытяжку центрифугируют.

Определение активности о–дифенолоксидазы (Е0). К 1 мл центрифугата (ферментная вытяжка) добавляют 3 мл дистиллированной воды, 2 мл 0,1 %–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10 %–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии нескольких капель крахмала. Параллельно проводят контрольное определение с прокипяченной вытяжкой (1 мл вытяжки и 3 мл дистиллированной воды кипятят 1 минуту, затем добавляют 1 мл воды взамен испарившейся при кипячении, и все необходимые реактивы, как и в случае с опытной пробой).

Активность выражают в мл 0,01 н раствора йода на 1 г испытуемого материала по разности контрольной и опытной пробы.

Определение суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы в присутствии перекиси водорода (Ео+n).

К 1 мл центрифугата добавляют 3 мл дистиллированной воды,1 мл 0,4%–ного раствора перекиси водорода, 2 мл 0,1%–ного раствора аскорбиновой кислоты и 1 мл 0,02 М раствора пирокатехина. (Все растворы и вода должны иметь температуру 18–20 °С). Смесь встряхивают 2 минуты, добавляют 1 мл 10%–ного раствора фосфорной кислоты и титруют из микробюретки 0,01 н раствором йода в присутствии крахмала.

Активность пероксидазы (Еn) определяют по разности суммарной активности о–дифенолоксидазы и пероксидазы и активности одной о–дифенолоксидазы:

Еn = Еo+n – Еo

 

Результаты записывают в таблицу 6.

 

Таблица 6 - Основные параметры опыта и его результаты

 

Материал Ферменты
  о-дифенолоксидаза и пероксидаза о-дифенолоксидаза пероксидаза
  Vo Vk Vk-Vo Ео+п (Vk-Vo)20 ¾¾¾ n Vo Vk Vk-Vo Ео (Vk-Vo)20 ¾¾¾ n   Еn = Еo+n – Еo
     
                   

 

Где: Vo– объем, пошедший на титрование опытной пробы, мл 0,01 н I2;

Vk – объем, пошедший на титрование контрольной пробы, мл 0,01 н I2;

Vk-Vo – разность показаний титрования контрольной и опытной пробы, мл 0,01 н I2;

Еo+n – активность о–дифенолоксидазы и пероксидазы мл 0,01 н. I2/г;

Еo – активность о–дифенолоксидазы, мл 0,01 н. I2/г;

Еn – активность пероксидазы, мл 0,01 н. I2 / г;

n– навеска, г.

Материалы и реактивы: картофель, солод, мука, капуста, хрен, яблоки; 0,3 М раствор ацетатного буфера рН = 4,7 (см. Приложение В, п.12); 0,1 %–ный раствор аскорбиновой кислоты; 0,02 М раствор пирокатехина; 0,4 %–ный раствор пероксида водорода; 10 %–ный раствор ортофосфорной кислоты; 0,01 н. раствор йода; крахмал, индикаторный раствор (см. Приложение В, п.13).

Оборудование: ступки; пипетки на 20 мл; колбы на 50 мл; микробюретки; центрифуга.