Ферментативный гидролиз крахмала
Крахмал - основной биополимер зернопродуктов. Состоит из смеси двух полисахаридов - амилозы (20-30 %) и амилопектина (80-70 %). В амилозе остатки глюкозы соединяются в длинные цепи посредством α-1,4-глюкозидных связей. Амилопектин имеет более сложное строение: к основной цепи (20-30 глюкозных остатков, связь α-1,4) присоединяются боковые (15-18 глюкозных остатков, связь α-1,6).
При затирании создаются благоприятные условия для гидролиза крахмала, а именно: механическое разрушение структуры крахмальных зерен, повышенная температура, наличие избытка воды. Поэтому степень гидролиза увеличивается по сравнению со степенью гидролиза при солодоращении в 10-15 раз. При гидролизе крахмала различают 3 стадии: клейстеризацию, разжижение, осахаривание.
Клейстеризация происходит при нагревании суспензии крахмала в воде. Зерна крахмала увеличиваются в объеме в 60-100 раз. Разрывается оболочка зерен, и образуется вязкий гель-клейстер. Клейстеризованный крахмал легче подвергается действию амилаз, чем неклейстеризованный. Процесс клейстеризации протекает ступенчато в связи с различием в размерах отдельных крахмальных зерен. Крупные зерна клейстеризуются лучше, чем мелкие. Температура клейстеризации зависит от структуры зерна, от присутствия в растворе различных веществ. Например, щелочи ускоряют клейстеризацию. Клейстеризации способствует также наличие в растворе амилаз. Температура клейстеризации ячменного крахмала 75-80 ºС, рисового - 80-85 ºС, кукурузного - 65-75 ºС, пшеничного - 60-70 ºС, а солодового - 60 ºС.
Разжижение крахмального клейстера протекает под действием α-ами-лазы, которая разрывает длинные цепи крахмала на более короткие. Разжижение сопровождается резким снижением вязкости клейстера.
Осахаривание. Осахариванием называется процесс расщепления крахмала до сахаров и низкомолекулярных, не дающих окраски с йодом декстринов. Осахаривание осуществляется совместным действием солодовых амилаз, основными из которых являются α- и β-амилазы. Солодовые амилазы отличаются характером действия на компоненты крахмала и своими оптимальными условиями действия.
α-Амилаза - эндофермент. Действует на глубинные связи молекулы амилозы и амилопектина беспорядочно путем случайного выбора. Гидролизует амилозу до мальтозы и небольшого количества глюкозы и мальтотриозы, а амилопектин - до низкомолекулярных конечных декстринов и мальтозы.
Схема гидролиза крахмала α-амилазой:
крахмал низкомолекулярные декстрины (много)
мальтоза (мало) + глюкоза, мальтотриоза (очень мало)
Оптимальные условия действия фермента в заторе: рН 5,7; температура 70-75 ºС.
β-Амилаза - экзофермент. Действует на крахмальную цепочку с нередуцирующего конца, отщепляя по молекуле мальтозы. Если количество глюкозных единиц в цепи амилозы четное, то она под воздействием β-амилазы полностью превращается в мальтозу, если нечетное, то наряду с мальтозой образуется и небольшое количество мальтотриозы. При действии β-амилазы на амилопектин образуется мальтоза и высокомолекулярные β-декстрины, которые в дальнейшем гидролизуются до низкомолекулярных α-амилазой.
Схема гидролиза крахмала β-амилазой:
крахмал мальтоза (много) + высокомолекулярные
β-декстрины (много) + мальтотриоза (мало)
Оптимальные условия действия фермента в заторе: рН 5,4-5,6; температура 60-65 ºС.
Гидролиз крахмала происходит при совместном действии обеих амилаз. Под действием α-амилазы на глубинные связи крахмальной цепи образуется дополнительное количество нередуцирующих концов, что повышает продуктивность β-амилазы. Под действием β-амилазы образуются высокомолекулярные декстрины, которые легко расщепляются до низкомолекулярных α-амилазой.
Так как амилазы различаются температурными оптимумами, то и максимум своего действия проявляют на различных стадиях затирания. Во время выдержки затора при температуре 63 ºС (мальтозная пауза) действует в основном β-амилаза, и главным продуктом гидролиза является поэтому мальтоза. При паузе осахаривания - выдержка затора при 70 ºС - действует в основном α-амилаза с образованием большого количества декстринов.
При осахаривании идет постепенное уменьшение молекулы крахмала: сначала образуются амилодекстрины (м.м. 10-20 тыс., дают с йодом синее и фиолетовое окрашивание), затем - эритродекстрины (м.м. 6250-7000, дают с йодом красно-бурый цвет) и далее - ахродекстрины и мальтодекстрины (м.м. 3700 и менее, йодом не окрашиваются). В пивном сусле не должно быть амило- и эритродекстринов, но для создания полноты вкуса и пенистости должны присутствовать ахро- и мальтодекстрины.
На гидролиз крахмала под действием амилаз - амилолиз влияют следующие факторы: температура, рН среды, концентрация затора, присутствие в среде активаторов или ингибиторов амилолитических ферментов.
Температура затирания влияет как на скорость гидролиза, так и на соотношение образующихся продуктов. В начале затирания скорость ферментативного распада крахмала увеличивается с повышением температуры. Однако при высоких температурах наблюдается инактивация ферментов, что негативно отражается на скорости амилолиза.
Различие в температурных оптимумах α- и β-амилаз позволяет целенаправленно регулировать углеводный состав сусла. Если необходимо получить сусло, богатое декстринами, то осахаривание проводят при высоких температурах (70-72 ºС), если требуется повысить степень сбраживания сусла, то увеличивают продолжительность выдержки затора на мальтозной паузе (63-65 ºС).
Определенное влияние на амилолиз оказывает рН затора. Несмотря на некоторое отличие в оптимальных значениях активной кислотности у α- и β-амилаз, считают, что рН 5,4-5,6 может рассматриваться в качестве оптимального для обеих амилаз.
На степень гидролиза крахмала влияет и концентрация затора. В концентрированных заторах больше защитных коллоидов, однако отмечается затруднение осахаривания и снижение содержания в сусле сбраживаемых сахаров, что можно объяснить ингибированием амилаз продуктами гидролиза крахмала. В концентрированных заторах из-за высокой вязкости затрудняются также диффузионные процессы между субстратом и ферментами.
На активность амилолитических ферментов, а следовательно, и на амилолиз влияют ионы некоторых металлов. Так Са++ способствует активации и стабилизации α-амилазы. Ионы тяжелых металлов снижают активность амилаз. Ухудшается осахаривание и при высоком содержании в заторе полифенольных веществ.
При правильном проведении процесса амилоза сусло имеет следующий углеводный состав (в % от общего количества):
- мальтоза 38-50;
- глюкоза 8-10;
- фруктоза 1-3;
- сахароза 2-6;
- мальтотриоза 11-19;
- мальтотетраоза 2-6;
- декстрины 14-22.
Общее количество углеводов в сусле составляет около 85 % экстракта.
Гидролиз белковых веществ
Белки - биополимеры, состоящие из остатков аминокислот, соединенных пептидной связью.
Правильному распаду белковых веществ при затирании уделяют большое внимание. Продукты гидролиза белков влияют на органолептические свойства пива и его стойкость, а также необходимы дрожжам для питания.
Из общего количества белка, содержащегося в солоде, примерно 35 % переходит в сусло. Более половины этого количества уже находится в солоде в растворенном состоянии. При смешивании дробленого зерна с водой в раствор переходит водорастворимый ячменный альбумин-лейкозин. Растворяется и глобулин-эдестин, так как затор содержит достаточное количество солей. Переходят в раствор также полипептиды и аминокислоты, образовавшиеся в процессе солодоращения. Данные продукты не выделяются из раствора во время кипячения и называются «стойко растворимыми белками». Настоящие же белки во время кипячения коагулируют. Другая половина белковых веществ переходит в сусло под действием протеолитических ферментов - эндо- и экзопептидаз.
Эндопептидазы действуют на глубинные пептидные связи и расщепляют белки до пептонов, полипептидов, пептидов и небольшого количества аминокислот. Солодовые эндопептидазы подразделяются на кислые, нейтральные и щелочные. Наибольшей активностью обладают кислые эндопептидазы. Максимальную активность эта группа ферментов проявляет в заторе при рН 4,6-5,0 и температуре 50-60 ºС. Гидролиз белка при затирании связан в большей мере с действием этой группы ферментов, поэтому при затирании образуются более сложные продукты гидролиза, чем при солодоращении.
Экзопептидазы подразделяются на амино-, ди- и карбоксипептидазы. Карбоксипептидаза действует на белковую молекулу с С-конца, а аминопептидаза - с N-конца. Дипептидаза гидролизует дипептиды. Оптимальные значения активной кислотности у ди- и аминопептидазы находятся в щелочной зоне при рН 7-8, поэтому данные ферменты практически не действуют при затирании. Эти ферменты также термолабильны. Максимум своей активности проявляют при температуре 40-50 ºС. При нагревании затора до 55-60 ºС в сусле остаются лишь следы активности ди- и аминопептидазы. Из экзопептидаз при затирании активно действует лишь кислая карбоксипептидаза, проявляя максимум своей активности при рН 5,2 и температуре 50-55 ºС. Карбоксипептидаза стабильна в заторе и даже при 80 ºС сохраняет половину своей активности.
На гидролиз белковых веществ при затирании значительное влияние оказывают температура, рН, концентрация затора, продолжительность затирания, ионы металлов. Температура 50 ºС является оптимальной для распада белков при затирании. Но затор оказывает защитное влияние на ферменты, поэтому и при температуре 60 ºС идет еще активный гидролиз белков. Однако при высоких температурах получаются более сложные продукты распада белков.
Гидролиз белка активнее протекает в кислой среде, поэтому подкисление заторов интенсифицирует протеолиз.
Распад белка идет активнее в концентрированных заторах, что связано с уменьшением их рН.
Влияет на гидролиз белка и длительность затирания. С увеличением продолжительности процесса возрастает содержание в сусле общего количества белковых веществ, причем активно образуются низкомолекулярные продукты распада.
На протеолиз влияют присутствующие в заторе ионы солей. Так, Са++, Мg++ повышают активность эндопептидазы, а ионы хлоридов, сульфатов, натрия оказывают ингибирующее воздействие на фермент. Карбоксипептидазу активируют ионы хлоридов и сульфатов, а Mg++ отрицательно влияет на фермент.
Наряду с растворением и гидролизом при затирании под действием высоких температур происходит также превращение растворимых белковых веществ в нерастворимые, которые осаждаются - коагулируют.
Процесс расщепления белка во время затирания должен быть проведен таким образом, чтобы в полученном сусле содержалось 75-100 мг на 100 см3 общего азота с распределением фракций по Лундину:
А - 12-15 %;
В - 12-15 %;
С - 60-75 %.
Для обеспечения нормальной жизнедеятельности дрожжей в 100 см3 сусла должно содержаться не менее 25 мг аминного азота (медный способ) или 20-22 мг (нингидриновый метод).