МАТРИЧНИЙ СИНТЕЗ НУКЛЕЇНОВИХ КИСЛОТ

Синтез ДНК.Оскільки у молекулах ДНК закодована вся генетична інформація організму, синтез і відтворення їх є необхідним і жит-тєвоважливим процесом.

Процес синтезу ДНК називається реплікацією (копіювання, само-подвоєння), оскільки передача інформації відбувається в межах одного виду нуклеїнових кислот (від ДНК до ДНК). Реплікація відбувається у процесі росту і нормального поділу ДНК-вмісних структур (ядер, мітохопдрій, пластид в еукаріот), а також у процесі поділу бактеріальних клітин та під час розмноження вірусів.

Гіпотезу щодо механізму реплікації запропонували Д. Уотсон і Ф. Крік після того, як було встановлено, що молекула ДНК складається з двох взаємокомплементарних полінуклеотидних ланцюгів. Суть даного механізму полягає в тому, що синтез ДНК здійснюється на однолапцюговій матриці, роль якої викопує ланцюг молекули ДНК, що реплікується. Подвійна спіраль ДНК при цьому розкручується і на кожному з ланцюгів добудовується новий комплементарний ланцюг (утворюється репліка).

/~^ Пізніше було встановлено, що/для ДНК характерним є напівкон-сервативпий механізм реплікації (від англ. conserve — зберігати) — у кожній повій синтезованій молекулі один ланцюг «старий», одержаний з вихідної материнської ДНК, а другий — «повий», синтезований (дочірній), тобто реплікація проходить так, що два ланцюги — вихідний і реплікований, сполучаючись між собою, утворюють наступне покоління молекул ДНК. Внаслідок цього процесу з однієї вихідної молекули ДНК утворюються дві молекули — точні копії, репліки, абсолютно ідеитичніодпа одній і вихідній матричній молекулі ДНК. Як якісний, так і кількісний вміст залишків нуклеотидів у полінуклеотидних ланцюгах материнської і дочірніх ДНК повністю співпадає. Напівконсервативний механізм синтезу ДНК відіграє важливу роль у забезпеченні видоспецифічпої передачі генетичної інформації від покоління до покоління і є запорукою збереження сталості видів організмів.

Згідно з дослідженнями А. Корнберга, вихідними сполуками для синтезу ДНК є вільні дезоксирибонуклеозид-5-трифосфати азотистих основ (аденіну, гуаніну, цитозину, тиміну), які під впливом відповідних ферментів сполучаються між собою з утворенням полінуклеотидних ланцюгів. Загальну схему синтезу ДНК можна подати так:

4©4

Реплікація ДНК — багатоступінчастий процес, для здійснення якого необхідні певні умови і наявність чотирьох видів рибо- і де-зоксирибонуклеозид-5-трифосфатів, матриці у вигляді дволанцюгової ДНК, ферментів і білкових речовин, затравки (праймера), іонів металів (Mg²+, Mn²+).

Матрицею служить молекула ДНК, яка репл і кується. Разом з цим для здійснення реплікації необхідно близько 20 реплікативних факторів, що називаються ДНК-рспліказною системою, або репліси-мою. Важливими компонентами ДНК-репліказної системи є ферменти синтезу ДНК. У процесі реплікації беруть участь ферменти ДНК-залежні ДНК-полімерази (І, II, III) РНК-полімерази, ДНК-ліази, ек-зонуклеази, ДНК-лігази. Кожен з цих ферментів забезпечує здійснення певних етапів синтезу ДНК і часто виявляє кілька видів ферментативної активності. Зокрема, вважають, що ДНК-полімераза III, яка відіграє головну роль у процесі реплікації, має 5' -* 3' полімеразну і 3' -+■ 5' екзонуклеазну активності, ДНК-полімераза І має три види ферментативної активності: 5' —► 3' полімеразну, 3' -*■ 5' екзонуклеазну і 5' —- 3' екзонуклеазну. Цей фермент забезпечує розщеплення РНК затравки на матриці ДНК та процеси репарації пошкоджених ділянок молекули. ДНК-полімераза II за властивостями подібна до ДНК-полімерази І, однак для неї не характерна 5' -*■ 3' екзонуклеазна активність. Функції цього ферменту в клітині вивчені не достатньо. Фермент РНК-полімсраза забезпечує синтез затравного ланцюга РНК (праймера) на ДНК-матриці.

— Важливими компонентами ДПК-рспліказної системи є також білкові речовини, які забезпечують протікання ряду необхідних етапів синтезу ДНК, зокрема таких, як:

1) «впізнавання» місця початку реплікації ДНК ферментами ДНК-полімеразами;

2) локальне розкручування дуплексу ДНК і вивільнення однолан-цюгових матриць;

3) стабілізація утвореної структури;

4) синтез затравних ланцюгів (праймерів) для ініціації ДНК-полімерази III;

5) переміщення реплікативної вилки в ході копіювання;

6) закінчення синтезу та утворення нативної конформації молекули ДНК.

Ці процеси забезпечуються ДНК-зв'язуючими білками (ДЗБ), ДНК-розкручуючими білками (хеліказами), ДНК-стабілізуючими білками (гіразами) тощо.

Слід зазначити, що реплікація ДНК має певні особливості, зокрема, напівконсервативний механізм, одночасність синтезу обох ланцюгів, двонапрямленість реплікації, синтез дочірніх ланцюгів* у напрямку 5' -*■ 3', наявність праймера з вільною 3' —ОН-групоюдезоксирибози, фрагментарний характер реплікації.

5^і У Процес реплікації ДНК включає

три взаємозалежні і взаємозв'яза
ні етапи: ініціацію, елонгацію
і термінацію.
{, Ініціація.Цей етап синтезу

ДНк. оО'єднує процеси, які забезпечують початок синтезу поліну-клеотидного ланцюга. Суть їх полягає у формуванні реплікативної вилки та синтезі праймера.

Оскільки для забезпечення на-півконсервативного механізму синтезу ДНК необхідна наявність од-ноланцюгової матриці, важливою умовою початку реплікації є дестабілізація трьохмірної структури ДНК та розкручування її подвійної спіралі з утворенням реплікативної вилки (рис. 69).

Рис. 69. Реплікативна П. Зенгбушом)

В сукаріот, на відміну'від прокаріот, утворюється багато стартових точок реплікації — від 10 до 100 тисяч. Кожна з них розміщується в окремих ділянках поліну-клеотидпого ланцюга, і реплікація їх проходить незалежно. Такі самостійні одиниці реплікації називаються репліко нами. У бактерій роль реплїкону виконує хромосома. Отже, в еукаріот молекула ДІІК — це полірепліконна система, що містить велику кількість реплі-конів, з середини яких у двох напрямках рухаються реплікативні вилка (за вилки. ДНК при утворенні реплікативної вилки розкручується не по всій довжині, а невеликими ділянками — відрізками, що містять до 2 тисяч нсспарених основ. Утворення реплікативної вилки забезпечується білковими речовинами, які визначають точку старту реплікації та зумовлюють розкручування подвійної спіралі ДНК. В клітинах еукаріот ці процеси забезпечуються комплексною дією ДНК-розкру-чуючих білків. Так, топоізомерази руйнують суперспіралізовану структуру ДНК хроматину, свівелази або релаксуючі білки, зумовлюють розрив одного з ланцюгів ДНК, внаслідок чого стає можливим розкручування двоспіральної структури ДНК за участю хеліказ.

В результаті поетапної дії вищезазначених факторів двоспіральна молекула ДНК розкручується й утворюються дві одноланцюгові матриці. Оскільки в двоспіральній молекулі ДНК ланцюги антипара-лельні — один з них має напрямок 5' -»• 3', а інший — 3' -+■ 5', то після розкручування дуплексу утворюються одноланцюгові антипа-ралельні матриці. В зв'язку з тим, що реплікація за участю ДНК-полімерази III може проходити лише в напрямку 5' ->- З', напрямок реплікації одного ланцюга співпадає з напрямком реплікативної вилки, цей ланцюг названий ведучим, а ланцюг, реплікація якого протилежна напрямку реплікативної вилки,— тим, що запізнюється, другорядним.

Після розкручування подвійної спіралі та утворення реплікативної вилки наступає друга стадія ініціації — синтез праймера, або затрав-ного ланцюга, РИК на структурі ДНК-матриці. Необхідність цього процесу зумовлена тим, що ДНК-полімераза III не здатна самостійно розпочати синтез ДНК на структурі матриці з використанням вільних нуклеозидтрифосфатів. Тому для ініціації синтезу ДНК необхідна затравка, яка б містила вільну 3'—ОН-групу, за якою може здійснюватись ДНК-пзлі.меразна Ш реакція. "Встановлено, що функцію затравки викопують невеликі олігонуклсотидні фрагменти РНК, комплементарні ДНК-матриці. Затравка в середньому містить 8-— 10 нуклеотидів. Синтез затравного полінуклсотидного ланцюга каталізує мультиферментпий комплекс, так звана «праймосома». До складу праймосоми входять ферменти — специфічна ДНК-залежна РНК-полімераза (ДНК-праймаг;а), ДНК-залежна АТФ-аза, а також білкові фактори: ДНК-зв'язуючий білок (білок В), білок п' тощо. ДНК-Зв'язуючий білок визначає місце старту, з якого праймаза розпочинатиме синтез затравного ланцюга в напрямку 5' ->- 3'. Праймосома рухається по ланцюгах матриці і синтезує праймер. Цей процес розпочинається із приєднання до стартової точки ведучого полінуклеотид-ного ланцюга матриці ДНК-зв'язуючого білка. Далі за участю прай-мази проходить синтез затравного ланцюга РНК, комплементарного матриці ДНК- Після закінчення синтезу на ведучому ланцюгу праймосома переміщується на ланцюг, що запізнюється, й ініціює синтез праймера на ньому. По ланцюгу ДНК, що запізнюється, праймосома рухається до наступного місця ініціації в напрямку, протилежному напрямку синтезу ДНК, алеоднонапрямлсному з рсплікативіюю вилкою, синтезує затравку і знову переміщується вперед. Враховуючи це, білок В називають мобільним промотором реплікації. Енергія для руху праймосоми забезпечується завдяки активності АТФ-аз білка п .

Отже, в результаті дії праймосоми синтезується РНК-затравка па структурі ДНК-матриці. На 3'—ОН-кінці затравки замість праймосоми приєднується ДНК-залежна ДНК-полімераза III, яка використовує 3'—ОН-групу для продовження копіювання матричної молекули ДНК- Синтезом праймерів завершується процес ініціації.

^Елонгація,або подовження полінуклеотидного ланцюга, включає два процеси: реплікацію ділянок материнської ДНК і сполучення синтезованих ділянок між собою. Ці процеси забезпечуються ДНК-полі-меразою III, яка виявляє полімеразну та нуклеотидилтрансферазну активність. Отже, в цьому випадку ДНК-полімераза III діє па два субстрати: на спарений з матрицею кінець затравки, яка містить вільну ;У ОН-групу рибози, і на дезоксирибонуклеозид-5-трифоефати (дНТФ). Хімізм реакції поліконденсації полягає в нуклеофільній атаці а-атома фосфату дНТФ 3'—ОН-групою, яка міститься на кінці затравки. В результаті реакції дезоксирибопуклеозид-5-монофосфат приєднується за місцем атома водню гілпоксильної групи з утворенням З' -*- 5'-фосфодіефірного зв'язку і вивільненням пірофосфату Продукт реакції містить вільну 3'—ОН-групу, за якою знову повторюється аналогічна реакція, що дістала назву «ріст з хвоста»:

Ланцюг к

HN^S

Он он

■t 0 = Р-0-Р = 0 .

I I

Он он

В результаті багаторазового повторення цієї реакції здійснюється поступовий ріст нового полінуклеотидного ланцюга, комплементарного матричному ланцюгу ДНК.

Дослідженнями японський вчений Оказакі в 1968 р. встановив, що синтез полінуклеотидів ДНК на матричній ДНК проходить не безперервно, а окремими фрагментами, які дістали назву фрагментів Оказакі. Утворюються вони внаслідок приєднання до 3'—ОН-групи

праймерів 1000 —2000 дезоксирибонуклеотидних залишків. Послідовність нуклеотидів синтезованих фрагментів комплементарна нуклео-тидній послідовності відповідної ділянки ланцюга матриці.

Поступове нарощування фрагментів Оказакі триває доти, поки не досягне місця, де розташована нова затравка, з якої розпочинається» ріст нового фрагменту полінуклсотидного ланцюга.

Тепер вважають, що фрагментарний механізм реплікації властивий в основному полінуклеотидному ланцюгу, що запізнюється. Вважають, що для ведучого ланцюга фрагментація для нього не характерна.

За даними Оказакі, в живих клітинах має місце човниковий механізм реплікації. Суть його полягає в тому, що спочатку реплікація відбувається в напрямку 5' -*- 3' під час просування вперед по одному ланцюгу, а потім у напрямку 5' -*■ 3' продовжується в протилежному напрямку по другому полінуклеотидному ланцюгу матричної ДНК. Інакше кажучи, один полінуклеотидний ланцюг синтезується в напрямку реплікативної вилки, а інший — у протилежному.

Синтезовані фрагменти Оказакі на 5'-кінці дезоксирибози містять ковалентно зв'язану РНК-затравку. Остання за участю ДНК-поліме-рази І, що виявляє ендонуклеазну активність, видаляється. В міру видалення рибонуклеозидних мономерів праймера проходить їх заміна на комплементарні дезоксирибонуклеозидмоиофосфати. Здійснюється цей процес за участю ДНК-полімерази І. Далі фрагменти Оказакі під каталітичним впливом ферменту лігази сполучаються між собою й утворюють дочірній ланцюг ДНК- Два новосинтезованих ланцюги, сполучаючись із своїми комплементарними матрицями, утворюють дві дочірні молекули ДНК, кожна з яких містить один материнський і один дочірній ланцюги. 1/~ Термінація. Механізм термінації, або завершення синтезу ДНК, вибачено недостатньо. В_ геномі деяких бактерій термінацію здійснює спеціальний термінатор, в шішїх_„такии термінатор вГдсутшйГТо'мУ" припускають, що реплікація завершується після зустрічі двох репліка-тнвпнх вилок, які рухаються назустріч одна одній.

Процес реплікації проходить з досить високою швидкістю: 1000—₍2000 нуклеотидів за секунду у прокаріот і близько 100 нуклеотидів у еукаріот. Для цього процесу характерна велика точність. Так, у процесі реплікації на 10¹⁰ пар нуклеотидів трапляється лише одна помилка. Вилучення помилково включеного нуклеотиду (наприклад, урацилу замість тиміпу), зумовлює миттєве його видалення із синтезованого поліиуклеотидного ланцюга, і на його місце вводиться тимін (див. с 410).

Забезпечення точності реплікації є одним з важливих етапів передачі спадкової інформації від одного покоління до іншого.

Синтез РНКна матриці РНК.Учений М. С. Гершенсон і амери- \~ кінський біохімік Г. Тимін встановили, що крім реплікації існує й інший шлях синтезу ДНК, коли матрицею служить молекула РНК.

Оскільки передача генетичної інформації між різними видами нуклеїнових кислот (ДНК -*- РНК) називається транскрипцією^ (переписування), то процес, що протікає у протилежному напрямку (РНК -»-—»- ДНК), дістав назву зворотної транскрипції. Каталізує процес фермент РНК-залежна ДНК-полімераза, або ревертаза (зворотна транс-криптаза). Цей фермент було виділено в 1969—1970 pp. із тканин, інфікованих онкогеиними вірусами, а також із самих вірусів цієї групи, зокрема вірусу Раушера лейкемії мишей і вірусу саркоми Рауса. Ревертаза активується іонами Mn²+, Mg²⁺, причому першими ефективніше, ніж другими.

Вивчення будови ферменту, виділеного із вірусів мієлобластозу птахів, показало, що він складається з двох білкових субодиниць з мо-. лекулярною масою 110 000 і 70 000 і містить два атоми зв'язаного цинку. Для функціонування ферменту ревертази необхідна затравка і матричний ланцюг РНК- Спочатку на одноланцюговій РНК-матриці за участю ферменту ревертази синтезується одноланцюгова ДНК. Внаслідок цього утворюється гібридна РНК — ДНК молекула, яка далі виконує роль матриці для синтезу комплементарного полінуклеотид-ного ланцюга ДНК. Цей етап каталізує фермент РНК-залежна ДНК-полімераза. На останньому етапі за участю ферменту РНК-ази від РНК відщеплюється молекула ДНК. Далі така ДНК включається в геном інфікованої клітини і зумовлює переродження її в ракову. Однак зворотну транскриптазу виявлено і в культурах синцитіальних вірусів, які не викликають злоякісного переродження клітин. За певних умов здатність каталізувати синтез ДНК на РНК виявляють і ДНК-полімераза І та еукаріотичні ДНК-полімерази.

Відкриття процесу зворотної транскрипції має важливе теоретичне і практичне значення. Якщо раніше вважалось, що передача генетичної інформації в усіх організмів, за винятком РНК-вмісних вірусів, проходить лише від ДНК до ДНК і від ДНК до РНК, то нині встановлено, що вона може здійснюватись і від РНК до ДНК- Виявлення ферменту ревертази має важливе значення для ранньої діагнос-

1 відщеплюється пірофосфат від другого нуклеозидтрифосфату. Окремі етапи синтезу РНК полано на рис. 70.

Елонгація. На стадії елонгації перший активний центр ферменту зв'язується з 3'—ОН-групою рибози другого нуклеотиду і РНК-полі-мераза переміщується (транслокується) на поверхні ДНК в напрямку росту ланцюга.[За цих умов другий активний центр ферменту сполучається з наступним (третім) нуклеотидом. Останній знову за участю фэсфэд і ефірного зв'язку сполучається з другим нуклеозидмонофосфа-том. Так відбувається ріст (синтез) нуклеотидного ланцюга в напрямку 5 -»- 3 до повного завершення біосинтезу РНК.

Слід зазначити, що в системах in vivo швидкість елонгації досягає близько 40—50 нуклеотидів в секунду, у системах in vitro цей процес проходить менш інтенсивно — 15—40 нуклеотидів в секунду. Разом з цим транскрипція здійснюється з досить великою точністю. Частота помилок становить 2 • ІО^-3—2 • 10~⁴, тобто на 2000—20 000 нуклеотидів може включатись один неправильний нуклеотид. Хоч ці помилки і малі, однак вони значно більші, ніж помилки при реплікації ДНК, де частота помилок становить 10~¹⁰. Однією з причин цього є те, що в процесі реплікації бере участь додатковий механізм контролю — виправляння помилок за участю ДНК-полімерази І.

Терм і нація. Процес обриву ланцюга, порівняно з іншими проце-сами синтезу-рНК, менш вивчений^Вважають, що ДНК має специфічні термінуючі послідовності нуклеотидів. РНК-Полімераза, підходячи до них, перестає функціонувати. При цьому синтезований полінуклео-тидний ланцюг РНК і молекула ферменту відділяються від ДНК-матриці.

Безпосереднім продуктом транскрипції є різні види РНК. їх називають первинними тпанскриптами, або попередниками відповідних цитоплазматичних РНК, і позначають пре-РНК. Процес перетворення даних пре-РНК у функціонально активні форми РНК називається процесингом, або дозріванням. Процесинг відбувається в ядрі і має свої особливості для кожного виду РНК-

Важливою групою первинних транскриптів в ядрі є так звана гетерогенна ядерна РНК (гя-РНК). Основну фракцію гя-РНК становить матрична (інформаційна) РНК (пре-мРНК).

Для більшості пре-мРНК, синтезованих в ядрі еукаріот, існує три основні етапи процесингу: кепування і метилювання 5'-кінця, по-ліаденнлування З'-кінця, видалення (вирізання) некодуючих ділянок (інгронів) з полі нуклеотидного ланцюга та сполучення (зшивання) кодуючих ділянок (екзонів). Цей процес називається сплайсингом (від англ. splicing — з'єднувати, зилітати).

Для мРНК, які синтезуються в клітинах прокаріот, процесинг не характерний.

Модифікація полінуклеотидиих кінців пре-мРНК відбувається так. До б'-кінця пре-мРНК приєднується олігонуклеотид, який

Рве. 70. Схема синтезу РНК на матриці ДНК —етапи ініціації та елонгації (эа I. П. Ашмаріним)

називають «кепом», або «ковпаком». «Кеп» складається з двох-трьох ме-тильованих нуклеотидів. Кінцевим нуклеотидом «кепа» є 7-метилгуа-нозин, сполучений з полінуклеотидним ланцюгом РНК не по типу 5' -v 3', а 5' -*■ 5'-фосфодіефірним зв'язком. Вважають, що метил ьо-ваний «кеп» захищає мРНК від руйнування ферментами.

уДоЗ'-кінця пре-мРНК приєднується поліаденіловий фрагмент — no.itrtft), який складається з 150—200 аденілових нуклеотидів. Вважають, що полі (А) — фрагмент, очевидно, необхідний для транспорту мРНК з ядра в цитоплазму, а також для підвищення її стабільності. Сплайсинг пре-мРНК відбувається шляхом вилучення неінформатив-них ділянок (інтронів), починаючи з 5'-кінця за участю екзо- та ендо-нуклеаз. Інформативні ділянки, які залишились, тобто екзони, за участю спеціальних РНК-лігаз сполучаються в єдиний полінуклеотидний ланцюг.

[Певним змінам (процесингу) піддаються й інші пре-РНК, зокрема пре-рРНІС і пре-тРНК.

Пре-рРНК є попередником рибосомних РНК як у клітинах прокаріот, так і еукаріот. У прокаріот всі три рРНК-25 .$, 16 S і 5S утворюються з однієї молекули пре-рРНК-30 S, яка має молекулярну масу —^2- 10^і. Спочатку окремі азотисті основи, що входять до її складу, піддаються мстилюванню. На наступному етапі пре-рРНК розщеплюється з утворенням 17 5- і 25 S-проміжних РНК- Далі від них поступово за участю нуклеаз відщеплюються нуклеотиди й утворюються характерні для прокаріот 16 S і 23S-pPHK. 5 5-рРНК утворюється окремо з З'-кінцевої ділянки пре-рРНК-'\У JLeyKapioT 18 S_l_28_^j.5₁8 S-pPHK утворюються в декілька етапів з великої45 S пре-рРНК. ГІроцесинг відбувається в ядерці. Спочатку проходить також метилювання нуклеотидів, а потім відщеплення нуклеотидів, що призводить до утворення 18 S, 28 S і 5,8 S-pPHK. /

тРНК також утворюються з довших полінуклеотидн'их ланцюгів пре-тРНК шляхом ферментативного відщеплення зайвих нуклеотидів з 5'- і З'-кінців молекули. У багатьох випадках з однієї молекули пре-тРНК утворюється дві і більше (до 7) молекул тРНК- У ході процесингу крім відщеплення нуклеотидів з кінців поліпуклеотидного ланцюга проходить ще ряд змін. По-церше, з окремих пре-тРНК до З'-кінця приєднується нуклеотидна послідовність ЦЦА, в інших пре-тРНК цей З'-кінцевий триплет утворюється в процесі транскрипції. По-друге, багато азотистих основ нуклеотидів зазнають різних модифікацій (деякі метилюються, інші — дезамінуються, відновлюються тощо).

І, нарешті, слід зазначити, що синтез РНК істотно відрізняється від реплікації ДНК. Насамперед, він є консервативним, а не напівкон-сервативним — продукт синтезу не включає жодних компонентів матриці. Цікавим є і той факт, що ферменти синтезу РНК, тобто РНК-полімерази, специфічні відносно різних матриць і навіть їх окремих

ділянок. Крім того, для матричного синтезу РНК не потрібна затравка. Процес синтезу починається взаємодією двох нуклеотидів. І, нарешті, процес транскрипції, на відміну від реплікації, проходить переважно з одного полінуклеотидного ланцюга ДНК-матриці.

Запитання і вправи для самоконтролю

1. Схарактеризуйте процес розщеплення нуклеопротеїдів у кишках.

2. Під впливом яких ферментів відбувається розщеплення нуклеїнових кислот?

3. Перечисліть особливості внутрішньоклітинного розщеплення нуклеїнових кислот.

4. Запишіть схеми реакцій розщеплення нуклеотидів і нуклеозидів.

5. Запишіть рівняння реакцій перетвореная пуринових основ на кінцеві продукти.

6. Схарактеризуйте шляхи розщеплення піримідинових основ.

7. Опишіть шляхи синтезу пуринових і піримідинових нуклеотидів.

8. Наведіть загальні схеми синтезу ДНК і РНК.

9. Перечисліть та поясніть основні етапи синтезу ДНК.

10. Схарактеризуйте процес синтезу ДНК на матриці РНК.

11. Схарактеризуйте основні етапи синтезу РНК.

РОЗДІЛ XII. ОБМІН ВУГЛЕВОДІВ