II. Значение микробиологической промышленности
Некоторые продукты микробиологического синтеза давно использовались человеком (например, пекарские дрожжи), но широкое промышленное применение микробиологического синтеза получил начиная с 40—50-х гг. 20 в.
Прогресс в этой области связан прежде всего с открытием пенициллина, что побудило начать детальные исследования у микроорганизмов продуктов обмена веществ, обладающих физиологической активностью. Освоение в промышленных масштабах производства пенициллина привело к решению многих микробиологических, технологических и инженерных задач. Это, наряду с расширением производства дрожжей как белково-витаминных добавок к кормам, послужило основой для развития промышленного микробиологического синтеза. Так, в частности, были созданы специальные аппараты — ферментёры, с помощью которых можно вести технологический процесс биосинтеза без доступа посторонних микроорганизмов, снабжённые устройствами для перемешивания среды и для подачи стерильного воздуха.
Технологически современный процесс микробиологического синтеза состоит из ряда последовательных этапов (операций).
Главные из них:
· подготовка необходимой культуры микроорганизма-продуцента;
· подготовка питательной среды;
· выращивание посевного материала; культивирование продуцента в заданных условиях, в ходе которого и осуществляется микробиологический синтез, часто называемый ферментацией (например, ферментация антибиотиков);
· фильтрация и отделение биомассы;
· выделение и очистка требуемого продукта, когда это необходимо;
· сушка.
Процессы выделения и очистки, часто занимающие важное место среди других технологических операций, определяются химической природой получаемого вещества и могут включать экстракционные и хроматографические методы, кристаллизацию, осаждение и др.
Наиболее прогрессивным способом культивирования считается непрерывный — с непрерывными подачей питательной среды и выводом продуктов микробиологического синтеза. Так производят, например, микробную биомассу (кормовые дрожжи). Однако непрерывный способ разработан далеко ещё не для всех процессов микробиологического синтеза, и большинство метаболитов (аминокислоты, антибиотики, витамины) получают периодическим способом — с выводом продукта в конце процесса. В некоторых случаях (например, при производстве ряда ферментов) продуценты выращивают не в ферментёрах с аэрацией и перемешиванием (глубинный способ), а на поверхности питательной среды — т. н. поверхностным способом.
Для производства разнообразных продуктов микробиологического синтеза в СССР была создана микробиологическая промышленность, уже выпускающая большой ассортимент соединений разных классов. Работы в области микробиологического синтеза проводятся почти во всех промышленно развитых странах. Во многих из них продукты микробиологического синтеза являются важной составляющей экономики страны, например производство ферментов и аминокислот — в Японии, лекарственных препаратов — в Венгрии.
http://studopedia.ru/2_95768_mikrobiologicheskiy-sintez.html
III. Продукция микробиологической промышленности
Антибиотики
Большое число антибиотических веществ, образуемых различными группами микроорганизмов, являются продуктами жизнедеятельности собственно бактерий. Однако лишь немногие из них нашли практическое применение, так как большинство бактериальных антибиотиков токсично для микроорганизмов. Часть этих антибиотиков используется в медицинской практике, другие нашли применение в пищевой и консервной промышленности. Они предохраняют от порчи мясные, рыбные, молочные и другие скоропортящиеся продукты. Некоторые из бактериальных антибиотиков употребляют в сельском хозяйстве как добавки к корму домашних животных.
По химической природе почти все бактериальные антибиотики – полипептиды или белки.
К настоящему времени известно около 1000 антибиотиков бактериального происхождения, но мы остановимся лишь на некоторых из них, имеющих практическое или теоретическое значение.
В большинстве случаев при изучении бактериальных антибиотиков приходится иметь дело не с одиночными веществами, а с группой близких друг к другу по химическим и биологическим свойствам веществ, синтезируемых одним видом бактерий.
У разных бактерий антибиотики-полипептиды, по всей вероятности, образуются идентично. Процесс биосинтеза активируется полиферментными комплексами, близкими по типу действия. Однако некоторые антибиотики продуцируются на рибосомах.
А. Пенициллин (БЕККЕР)
Первым антибиотиком микробногопроисхождения, который начали производить промышленным путем, был пенициллин. Первоначально его получали методом поверхностного культивирования. Технология была весьма примитивна – продуцент культивировали в колбах или бутылках. Потребность в пенициллине была очень высока и объем его производства, хотя и в примитивных условиях, быстро увеличивался. Для культивирования продуцента использовали даже молочные бутылки. В каждую бутылку помещали питательную среду слоем толщиной 1 -4 см, что обеспечивало необходимые условия аэрации. Бутылки помещали в специальные корзины, стерилизовали, а затем охлаждали. Сухие споры или их водную суспензию вносили в бутылки особыми пульверизаторами или при помощи пипеток и ферментировали 5 – 10 суток при температуре 24°С.
В настоящее время во всем мире пенициллин получают так же как и многие другие антибиотики, методом глубинного культивирования.
В качестве продуцентов пенициллина широко используют штаммы культуры Penicillium chrysogenum, виды Penicillium образуют споры (конидии). В развитии мицелия наблюдается ряд различных фаз. В начале и середине развития мицелия в клетках накапливаются жиры. Позже их количество уменьшается, появляются вакуоли с гранулами рибонуклеополифосфатов, затем начинается автолиз. Интенсивный синтез пенициллина начинается при наличии большего количества биомассы мицелия, при полном использовании глюкозы и молочной кислоты в среде и при pH, близком к нейтральному.
Для получения пенициллина вначале размножают споры. Их можно выращивать на агаризированных средах, в состав которых входят, например, 0,5% мелассы, 0,5% пептона, 0,4% поваренной соли, 0,01% однозамещенного фосфата калия и 0,005% сульфата магния. Споры выращивают при температуре 25 - 27°С 4 – 5 суток.
В промышленности споры часто получают, выращивая мицелий в стеклянных флаконах на просяной среде. Высушенный споровый материал можно хранить при комнатной температуре.
Полученный споровый материал используют для засева инокуляров (1 – 3 флакона на аппарат, где мицелий размножают до количества 5 – 10% от объема посевных ферментаторов).
В посевных ферментаторах мицелий выращивают 12 – 18 часов, 15 – 20% объема культуральной жидкости используют для начала основной ферментации. Питательные среды для выращивания мицелия и биосинтеза пенициллина готовят обычно из кукурузного экстракта, лактозы, глюкозы, минеральных веществ и некоторых препаратов фенилуксусной кислоты – предшественников антибиотика.
Ждя стабилизации среды используют мел. Ферментации ведут при температуре 22 - 26°С, в границах рН среды от 5,0 до 7,5 при интенсивной аэрации среды. В течение 4 суток количесво пенициллина достигает максимума и ферментацию прекращают. Мицелий отделяют фильтрацией. Его можно использовать в животноводстве как источник белков и витаминов, а из культуральной жидкости выделяют пенициллин.
После отделения мицелия в фильтрате содержится 3 – 6% сухих веществ, из которых 30 – 40% составляют минеральные вещества, а 15 – 30% пенициллин.
В последнее время экстракцию и химическую очистку пенициллина ведут по непрерывной схеме. Чтобы использовать пенициллин и другие антибиотики в медицине, выделению и очистке активных веществ необходимо уделять особое внимание. Получение антибиотиков отличается от других отраслей микробиологического синтеза именно тем, что содержание активных веществ в культуральной жидкости весьма незначительно, поэтому их химическое выделение усложняется, кроме того, требуется гарантия высокой степени чистоты этих веществ.
Б. Тиротрицин
Впервые был получен Р. Дюбо в 1939 году при развитии бактерии Bacillus brevis, выделенной из почвы. Продуцент тиротрицина – аэробная, спорообразующая грамположительная бактерия.
Температура оптимум развития около 37°С. Для получения антибиотика бактерии выращивались в течение 4-5 суток при 37°С на жидкой питательной среде (обычно мясопептонный бульон), разлитой тонким слоем в матрацы. В процессе развития бактерий образующийся антибиотик в небольшом количестве выделяется в окружающую среду, а основная масса тиротрицина находится в бактериальных клетках.
При выделении антибиотика необходимо помнить, что большая часть его содержится в клетках бактерий, а следовательно, обрабатывать стоит как культуральную жидкость, так и бактериальную массу.
Тиротрицин обладает бактериостатическим бактерицидным действием в отношении грамположительных бактерий и главным образом гноеродных кокков. Преимущество тиротрицина состоит в том, что он действует на те патогенные микробы (например, фекальный стрептококк), на которые не влияют ни пенициллин, ни сульфаниламидные препараты. Грамотрицательные бактерии устойчивы к действию антибиотика.
В. Бацитрацины
Бацитрацины – полипептидные антибиотики, выделенные Б. Джонсоном с соавторами в 1945 году из культуры Bacillus licheniformis. Немного позже (1949) из культуры Bacillus subtilis была выделена смесь антибиотиков, которая получила название «эйфайвин». Позднее было выяснено, что полипептиды, входящие в эйфайвин, идентичны полипептидам бацитрацина, поэтому было принято решение упразднить название «эйфайвин» и сохранить лишь название «бацитрацин».
Бацитрацины получают при поверхностном или глубинном росте бактерий на соответствующих средах, содержащих глюкозу, лактат аммония и неорганические соли или соевую муку и глюкозу. При развитии Bacillus licheniformis и образовании бацитрацина очень важно наличие в среде определенного соотношения углерода и азота. При высоком показателе отношения углерод/азот в среде вырабатываются бацитрацины, но при повышенном соотношении азота к углероду и при развитии бактерий в среде с лактатом аммония преимущество образуется новая группа антибиотиков – лихениформины, в состав которых входят три антибиотика: лихениформин А, В и С.
Бацитрацины обладают высокой антибиотической активностью в отношении грамположительных бактерий и почти не действуют на отрицательные формы.
По спектру действия эти антибиотики близки к пенициллинам. Вместе с тем бацитрацины влияют на многие микробы, устойчивые к пенициллинам. Бацитрацины проявляют определенное синергидное действие с другими антибиотиками, и в частности с пенициллинами, стрептомицином, хлортетрациклином.
В медицинской практике бацитрацины используются преимущественно при местном лечении некоторых гнойных процессов. Их с успехом применяют в целях профилактики и лечения ряда хирургических инфекций, для лечения кожных заболеваний, пневмонии, бациллярной дизентерии и других заболеваний.
При добавке в корма сельскохозяйственных животных бацитрацины могут стимулировать их рост. Однако использование этих антибиотиков должно быть резко ограничено и находиться под строгим контролем.
Г. Полимиксины (Егоров)
Полимиксины – родственные антибиотические вещества полипептидной природы, образуемые различными штаммами Bacillus polymyxa и B. circulans.
П. Стенсли с сотрудниками описали некоторые свойства антибиотика, активного по отношению к грамотрицательным организмам. Эти же ученые решили назвать полученный антибиотик полимиксином и выявили продуцирующий его организм.
Обычно для получения полимиксинов используют среды, в состав которых кроме неорганических солей входят дрожжевой экстракт, глюкоза, а иногда и другие компоненты.
Для развития полимиксина в среде необходимо присутствие сложных растительных компонентов (кукурузный или дрожжевой экстракты, соевая, арахисовая или овсяная мука и другие аналогичные компоненты) или витаминов (биотин, тиамин, никотиновая кислота).
Выделение полимиксинов осуществляется разными способами. В одних случаях антибиотики адсорбируют углем и элюируют подкисленным водным ацетоном, метиловым и этиловым спиртами. Выделять антибиотики можно так же путем экстракции их из нефильтрованной культуральной среды изопропиловым спиртом в присутствии сульфата аммония. Для выделения полимиксинов используют и ионообменные смолы.
Полимиксины избирательно действуют на грамотрицательные бактерии. На грамположительные формы бактерий полимиксины действуют очень слабо. Многие полимиксины обладают фунгицидной активностью.
Под действием полимиксинов нарушается функция ферментов дыхательной цепи чувствительных микробов.
Полимиксины в виде мазей могут использоваться при лечении фурункулов, гидраденитов и других кожных заболеваний. Так же применяются при лечении менингитов, инфекций дыхательных путей и мочеполового тракта, наружного отита. Их часто используют в сочетании с другими антибиотиками.
Аминоксилоты.
В состав природных белков обычно входят следующие аминоксилоты: аланин, аргинин, аспарагин, аспарагиновая кислота, цистеин, глицин, глутаминовая кислота, гистидин, глутамин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, оксипролин, пролин, серин, тирозин, треонин, триптофан и валин. Восемь аминокислот организм животных не способен синтезировать самостоятельно, поэтому их называют биологически незаменимыми аминокислотами. К ним относятся фенилаланин, изолейцин, лейцин, лизин, метионин, треонин, триптофан и валин.
Эти аминокислоты должны постоянно и в нужном количестве поступать в организм вместе с пищевыми продуктами. Недостаток одной из этих аминокислот в пище может стать фактором, лимитирующим рост и развитие организма.
А. Лизин
Лизин в организме является не только структурным элементом белка, но и выполняет ряд важных биохимических функций – является предшественником карнитина и оксилизина, способствует транспорту кальция и стронция в клетки и др.
В настоящее время во многих странах препарат лизина добавляют к хлебу для повышения его биологической ценности, а также для улучшения внешнего вида. Доказано, что лизин улучшает аппетит, способствует секреции пищеварительных ферментов, предотвращает кариес у детей.
Лизин является самой дефицитной в кормах животных незаменимой аминокислотой. Установлено, что добавка лизина в количестве 0,1 – 0,4% к кормам значительно увеличивает продуктивность домашних животных.
Для биосинтеза лизина используют гомосериндефицитные мутанты ауксотрофных бактерий родов Brevibacterium, Micrococcus, Corynebacterium и др.
Продуценты лизина культивируются на средах, содержащих углеводы или уксусную кислоту, источники азота и кислород.
Б. Триптофан
Триптофан используют в медицине, а также как реагент в биохимических исследованиях; в небольших количествах он требуется для нужд животноводства. Триптофан получают из антраниловой кислоты, используя особые штаммы дрожжей Candida или Hansunella.
Антраниловая кислота ядовита. Синтезируя триптофан, упомянутые дрожжи освобождают клетки от этого вредного соединения, превращая его в важную для биосинтеза белков аминокислоту.
Для размножения дрожжей можно использовать мелассу, диффузионный сок сахарной свеклы, сахарозу или другие среды, содержащие усваиваемые источники углерода.
Органические кислоты
Микробиологическим путем из углеводов, спиртов или даже углеводородов можно получить различные органические кислоты – уксусную, молочную, лимонную, янтарную, итаконовую, фумаровую, глюконовую и др.
Продуцентами этих кислот могут быть бактерии, плесневые грибы или дрожжи. Микроорганизмы, продуцирующие молочную кислоту, а также вызывающие спиртовое брожение, в ходе эволюции приспособились к анаэробному образу жизни. Уксусная и лимонная кислоты в свою очередь образуются в аэробных условиях. По-видимому, кислоты играют определенную роль в борьбе с конкурирующей микрофлорой, а также являются резервными источниками углерода.