Електрофорез білків в агаровому гелі
Подібно до крохмального й акриламідного, агаровий гель є дуже м’яким носієм. На відміну від електрофорезу на папері, в агаровому гелі не відбувається інактивації білків, що дає змогу визначати активність окремих білкових фракцій безпосередньо в гелі після завершення електрофорезу. Приготування агарового гелю є набагато простішим, ніж приготування крохмального чи поліакриламідного гелів. Тривалість електрофорезу в агаровому гелі – 1–4 год.
Електрофорез сироватки крові проводять в 1% агарі в мединал-вероналовому буфері (рН 8,6) з іонною силою 0,05. Усі білки сироватки при рН 8,6 заряджені негативно і переміщаються в електричному полі в напрямі до анода. Однак практично всі білкові фракції сироватки, які рухаються повільно, переміщаються до катода. Аномальний напрям руху цих білків пояснюєюь наявністю в агаровому гелі електроендоосмотичного струму рідини, спрямованого від анода до катода, а також струму рідини, який виникає під час нерівномірного випаровування води з поверхні гелю. Випаровування призводить до нерівномірного розподілу електричного поля в гелі. Зменшити випаровування води можна трьома способами:
1) герметично закривати електрофоретичну камеру під час електрофорезу;
2) проводити електрофорез за низьких температур у холодильнику або в холодній кімнаті;
3) буферний розчин повинен бути попередньо охолоджений.
Реактиви
1. Веронал-мединаловий буфер (рН 8,6; іонна сила 0,1): у 500 мл дистильованої води розчиняють 17,52 г мединалу, додають 2,76 г вероналу і, переміщуючи, нагрівають у теплій водяній бані до розчинення вероналу. Тоді об’єм розчину доводять дистильованою водою до 1 л.
2. Агар – 1% розчин. Агар повинен бути чистим і прозорим. Готують 2% розчин на дистильованій воді. Гарячий розчин розливають у ванночки товщиною 1,0–1,5 см. Після застигання агарову пластинку розрізають на кубики, переносять їх у товстостінний стакан і промивають протягом двох діб під проточною водопровідною водою, тоді протягом доби – дистильованою водою, змінюючи її чотири–п’ять разів. Агар підсушують фільтрувальним папером, переносять у колбу, розігрівають, гарячий розчин розводять у два рази буферним розчином і тричі фільтрують через три шари марлі. Розчин арагу зберігають у холодильнику. Перед нанесенням на пластинку його нагрівають на киплячій водяній бані доти, поки в агарі не зникнуть пухирці повітря.
3. Амідовий чорний 10Б – 0,1% розчин у 2% оцтовій кислоті.
4. СН3СООН – 5% розчин.
Приготування агарових пластинок і проведення електрофорезу. Для приготування агарових пластинок використовують предметні скельця. Попередньо їх знежирюють, ретельно промивають водою і висушують. Скельця нумерують, викладають на строго горизонтальну поверхню і на кожне скельце обережно наливають піпеткою із широким носиком 4 мл агару. Пухирці повітря в агарі необхідно вивести піпеткою на край скла. Коли агар застигне і утвориться твердий гель, у ньому посередині вирізають лунку (кишеньку) для внесення досліджуваного розчину. Підготовлені скельця складають в електрофоретичну камеру. Агарове плато з’єднують з буферним розчином містками з фільтрувального паперу. В кожну лунку на пластинці вносять сироватку крові, попередньо розведену буферним розчином. На електрофореграму наносять приблизно по 100–300 мкг білка в об’ємі 0,01 мл. Прилад підключають до джерела струму. Повільно підвищуючи напругу, доводять силу струму до 20–25 мА (за напруги 200–300 В), електрофорез проводять протягом 3–4 год.
Обробка агарових пластинок. Після завершення електрофорезу струм вимикають, предметні скельця з агаровим гелем відразу виймають з камери і поміщають на 30 хв у 5% розчин СН3СООН. Кожну пластинку покривають смужкою фільтрувального паперу, змоченого в 5% розчині СН3СООН, для видалення води та солей, а згодом висушують за кімнатної температури протягом ночі. Для пришвидшення процесу висушування його проводять при 37°С або під потоком теплого повітря. Папір, який може приклеїтися до агарового шару, обережно знімають, попередньо розмочивши його водою. Перед зафарбовуванням агарове поле повинне бути абсолютно сухим і прозорим. Зафарбовування зразків на електрофореграмах проводять амідовим чорним 10Б протягом ночі. Фарбу, яка не зв’язалася з білками, відмивають 5% розчином СН3СООН. Відмиті електрофореграми висушують при 37°С.
Концентрувальний та розділювальний поліакриламідні гелі. Концентрація поліакриламіду в гелі може бути однорідною або градієнтною. Найчастіше концентрація поліакриламіду становить 10%, що дає змогу розділяти білки з молекулярною масою 10–150 кДа. Якщо необхідно аналізувати невідомі білки або використати більш широкий діапазон розділення білків, то застосовують градієнтні гелі. Наприклад, 4–12% трис-гліциновий гель є зручним для розділення білків у діапазоні від 30 до 200 кДа, тоді як 1–20% гелі зручні для розділення білків від 6 до 150 кДа. Зазвичай товщина SDS-ПААГ гелів становить 1,0 або 1,5 мм; проте для блотингу найліпше використовувати гелі завтовшки £1 мм. Компоненти, необхідні для приготування поліакриламідних гелів, змішують у послідовності (!) та співвідношеннях, неведених у таблиці.
Таблиця
| Розділювальний поліакриламідний гель | 8% | 10% | 11% | 12% | 15% | 17,5% | 20% | |
| 15 мл | H2O (мл) | 6,95 | 5,95 | 5,45 | 4,95 | 3,45 | 2,2 | 0,95 |
| 30% акриламідна суміш (мл) | 4,0 | 5,0 | 5,5 | 6,0 | 7,5 | 8,75 | 10,0 | |
| 1,5 М трис-HCl, pH 8,8 (мл) | 3,75 | 3,75 | 3,75 | 3,75 | 3,75 | 3,75 | 3,75 | |
| 10% SDS (мл) | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | |
| 10% персульфат амонію (APS) (мл) | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | 0,15 | |
| TEMED* (мл) | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | 0,006 | |
| Концентруючий поліакриламідний гель | 5% | |||||||
| 4 мл | H2O (мл) | 2,76 | ||||||
| 30% акриламідна суміш (мл) | 0,66 | |||||||
| 1,0 М трис-HCl, pH 6,8 (мл) | 0,5 | |||||||
| 10% SDS (мл) | 0,04 | |||||||
| 10% персульфат амонію (мл) | 0,04 | |||||||
| TEMED* (мл) | 0,004 |
* N,N,N,N-tetrametyhyl-Ethylenediamin (N,N,N,N-тетраметил-етилендіамін)
Суміш компонентів розділювального поліакриламідного гелю обережно вносять у простір між двома скляними пластинками, після чого нашаровують 0,1% SDS для 10% гелів і менше або ізобутанол для гелів більшої концентрації. Через 30 хв (після полімеризації гелю) нашарований SDS або ізобутанол видаляють за допомогою фільтрувального паперу, а між пластинками заливають концентрувальний гель і вставляють гребінку. Після полімеризації концентрувального гелю, яка відбувається протягом 40 хв, скляні пластинки з гелем поміщають у камеру для електрофорезу.
Електродні буфери. Для проведення електрофорезу білків найчастіше використовують два типи буферів: трис-гліциновий і трис-трициновий. Ці електродні буфери можуть включати 0,1% детергент, найчастіше SDS. Система трис-гліцинового буфера є зручною для розділення білків у широкому діапазоні молекулярних мас (6–200 кДа), її можна використовувати для електрофорезів білків як у денатуруючих умовах, так і в неденатуруючих. Трис-тріцинова система
є ліпшою для розділення білків з низькою молекулярною масою (<10 кДа), які потребують попередньої денатурації та відновлення перед нанесенням у гель. Обидві буферні системи сумісні з перенесенням білків на мікропорову мембрану. Зазвичай електродні буфери готують 10-кратної концентрації і розводять безпосередньо перед використанням.