Клондалған жануарлар
Клондау – алғашқы бір молекуладан, жасұшадан немесе дарақтан көп үлгілер алу процессі. Клондалған жануарларға бір дарақтан (немесе бір ұрықтан) шыққан генетикалық ұқсас ағзалардың тобын жатқызады.
Мал шаруашылық тәжірибеде «құрастырылған» жануарларды алу технологиясының екі түрі бар – түрдің ішінде және түрлердің арасында. Түрдің ішінде «құрастырғанда» клондалған, түрлердің арасында «құрастырғанда» - химералық жануарлар алынады.
Клондалған жануарларды алу екі әдісін айырады:
Имплантацияға дайындалған ұрықтың дисекция әдісі. Осындай әдіспен алған жануарларды монозиготтық егіздер деп атайды.
Энуклеарды жұмыртқа жасұшаларына сома жасұшаларынан алынған ядроны отырту.
Дисекция әдісі. Монозиготты жануарлар алу негізінде тотипотенттік (әр бір бластомераның ұрықтан бөлінгенде өмір сүре алатын тұқым беру қасиеті) жатыр, ал осындай әдіспен клондарды алу негізінде жануарлардың биологиялық ерекшеліктері жатыр – бір жұмыртқалы егіздерді табу.
Монозиготты жануарларды алу әдістемесі келесі процедуралардан тұрады.
1. Ұрғашы-донордың жыныс жолдарынан 2-8 бластомералық бөліну кезеңіндегі ұрықтарды алу.
2. Пеллюцид зонасын алу. Алу екі әдісін айырады: 1) микроманипулярлы құралдың астында механикалық бөлу; 2) фермент проназаның көмегімен ферментативтық әсер ету.
3. Ұрықты бөлек бластомераларға бөлу.
4. Бөлініп алынған бластомераларды энуклеардық жұмыртқа жасұшасына инъециялау.
5. Құрастырылған ұрықты агар цилиндіріне кіргізу. Агар ұрғашының жыныс жолында ерімейді, ұрыққа дамуға жағдайлар тұылады.
6. In vivo культивирлеу.Ұрықты агармен бірге реципиенттің жұмыртқа жолына кіргізеді. Реконструкциядан өткен ұрықтарды культивирлеу үшін реципиент ретінде қойлармен қолданады. Ұрықтарды бластоциста кезеңінедейін культивирлейді. Кейіннен лапаротомия әдісімен бластоцистаны жұмыртқа жолынан алып, агарды алып тастап, ұрықты бағалайды.
7. Биологиялық толық ұрықтарды ұрғашы-реципиенттің ипсилатералдық мүйізшесіне еңгізеді.
Энуклеация әдісі. Әдіс келесі процедуралардан тұрады:
1. Овуляциядан өткен жұмыртқа жасұшаны донордың репродуктивтық жолынан алып дайындау.
2. Микроинемен ұрықтандырылмаған жұмыртқа жасұшаны полярлы дененің астында кесіп цитохалазин қосылған фосфаттық ортаға салады.
3. Пипеткамен полярлы денені және оның қасындағы цитоплазманы бір сағат культивирлеуден кейін сорып алады. Сонымен жұмыртқа жасұшасы екіге бөлінеді. Полярлы дененің бар жартысында метафаза ІІ кезеңіндегі хромосома бар (жұмыртқа жасұшаның «ядролық» жартысы). Екінші бөлекте ядролық құрылымдар жоқ («энуклеардық» жарты).
4. Жануарлардың сома жасұшаларынан бөліп алған ядроларды «энуклеардық» жұмыртқа жасұшасына салады.
5. Электроқосылудан кейін ұрықтың цитоплазмасымен ядроны фосфаттық буферге салады.
6. Ұрықтарды агарға салу (әдістемесі жоғарыда көрсетілген).
7. In vivo культивирлеу. Реципиенттің жұмыртқа жолдарына ұрықтар отырғызылып 4-6 күн инкубацияға жатады.
8. Ұрықтарды алып биологиялық толықтығын анықтау.
9. «Құрастырылған» ұрықты ақырғы реципиентке отырту.
Химералық жануарлар
Химера – бір неше эмбриондардың бластомераларының қосылу үдірістерінен шыққан жануарлар. Химералар екі немесе одан да көп ұрықтануға дайын тұрған эмбриондардың бластомераларының қосылуымен алынады. Жұмыстар өткізгенде генетикалық жыныс анықталмайды, сондықтан жыныс хромосомаларына сәйкес мозаикалар жаратылады (ХХ+ХХ, ХХ+ХУ). Генетикалық мозаикалардың ішінде фенотиптік еркектер көп болады. Гонадалардың дамуы басталған кезде ХУ-хромосомалардың 30 пайыз саны гонададан тестикул дамығанға жеткілікті. ХХ және ХУ хромосомды жасұшалар бір бірімен араласқан кезде химералық гонадалар тестикул бағытында дамиды. Ал химералық эмбрионар дамығанда ХХ және ХУ бластомералар бір біріне жақын болмаса, олардың қасында ана безге сәйкес гистогенез жаратылып, гермафродиттық даму басталады. Тышқандарда бір жағында ана без, бір жағында ұрық без дамыған жағдайлар бар.
Химералық жануарлар алу жолдары З. Макзарен және Н. Доурин жұмыстарында жазылған.
Химералар жасағанда екі әдіспен қолданады: 1) агрегациялық - бір ұрыққа әр түрлі генотипті екі немесе одан да көп бластомераларды қосу; 2) инъекциялық - бластоцистаның ішіне басқа ұрықтан алынған бластомераны кіргізу.
Агрегациялық әдіс. 8-12 бластомералық кезеңдегі әр түрлі генотипті ұрықтарды алады. Әдістеме келесі процедуралардан тұрады:
2. 8-12 бластомералық кезеңдегі ұрықтарды ұрғашы-донорлардың жыныс жолдарынан алу. Әр түрлі генотипті ұрықтарды алып, оларды 1 мл М16+БСА ортасынмен жуады.
3. Бас жақта көрсетілген әдіске сәйкес пеллюцид зонасын алу.
4. М16+БСА микротамшыға салып екі ұрықты біріктіреді және 37 градуста культивирлейді. Культивирлеген күні ұрықтарды пипетка көмегімен 2-3 рет агрегация өту үшін бір біріне жақындатады. Ұрықтар 24-48 сағат агрегация аяқталу үшін (бластоциста жаратылғанға дейін) инкубацияда болады.
5. Химералық ұрықтарды ұрғашы-реципиенттердің жыныс жолдарына транспланттайды.
Инъекциялық әдіс. Бластоциста кезеңіндегі ұрықтармен қолданады. Әдістеме келесі процедуралардан тұрады:
1. Ұрғашы-донорлардың жыныс жолдарынан әр түрлі бластоциста кезеңіндегі ұрықтарды алу. Әр түрлі генотипті ұрықтарды 1 мл М16+БСА ортасымен жуады.
2. Пеллюцид зонасын проназамен алу.
3. In vitro культивирлеу (37 градуста 1 сағат).
4. Ұрық-донордан бөлініп алынған бластомераларды ұрық-реципиентке инъекциялайды.
5. Химералық ұрықты 12 сағат in vitro культивирлеу.
6. Химералық ұрықты ұрғашы-реципиенттің жыныс жолына салу.
Сонымен, химералық жануарлар алғанда жасұшалардың гибридизациясы болмайды. Химералық жануарлар ұрпақтарға генетикалық мозаика қасиеттерін бермейді.
ҚОЛДАНҒАН ӘДЕБИЕТ
НЕГІЗГІ:
1. Мак-Ларен Э. Химеры млекопитающих ,М. Мир, 1979
2. Мухамедгалиев Ф.М., Тойшибеков М.М., Абильдинов Р.Б., Бердонгарова О.И., Джанабеков К.Д. Трансплантация зигот в племенном овцеводстве.- Алма-Ата: Наука, 1981.- 168с.
3. Серов О.Л.. Перенос генов в соматические и половые клетки. Новосибирск. 1985.
4. Карш Фр.Дж. Гормональная регуляция размножения у млекопитающих. Под ред. К.Остина, Р.Шорта.- Москва “Мир”.-1987.-с.8-31.
5. Эрнст Л.К. Трансплантация эмбрионов сельско-хозяйственных животных. М., 1989.
6. Завертяев Б.П.. Биотехнология в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота. Л., Агропромиздат,1989, с. 1-255.
7. Муромцев Г.С. и др. Основы сельскохозяйственной биотехнологии. Москва ВО «Агропромиздат», 1990.
8. Р.Е. Спиер, Дж. Гриффитс. Биотехнология клеток животных. Москва, ВО «Агропромиздат» 2 тома.
9. Гилберт С.. Биология развития. В 3-х томах. Биология развития. М. Мир, 1993.
10. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М. Мир, 2002. 589 с.
11. Корочкин Л.И. Биология индивидуального развития(Генетический аспект) М. МГУ, 2002, 264 с.
12. Шевелуха В.С., Калашникова Е.А., Воронин Е.С. и др. Сельскохозяйственная биотехнология. 2-е изд. М. Высшая школа, 2003.
13. Щелкунов С.Н. Генная инженерия. Новосибирск. Изд-во Новосибирского государственного университета. 2004.
14. Джамалова Г.А. Биотехнология животных. Алматы. Агентство «Маматай». 2004.
ҚОСЫМША:
1. Фанбрюн П.. Методы микроманипуляций. М., 1951.
2. Бландова З.К. и др. Линии лабораторных животных для медико-биологических исследований. М., 1983.
3. Дыбан А.П., Баранов В.С.. Цитогенетика развития млекопитающих. М., 1987.
4. Фрешни Р. Культура животных клеток. М., 1989.
5. Мурзамадиев А.М., Ертаев Е.Е., Салыкбаев Т.Н. Биотехнология в воспроизводстве овец.- Алма-Ата: Гылым, 1992.-88с.
6. Альбертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. В 3-х томах. М. Мир, 1994
7. Жимулев И.Ф. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск. Изд-во Новосибирского университета. Сибирское университетское издательство. 2002. 459 с.
8. Бочков Н.П. Клиническая генетика. Издание 2-е. Москва. Гэотар-мед. 2002.
9. Корочкин Л.И. Геном. Клонирование. Происхождение человека. М. Век 2. 2004.