Аллельспецифичный пцр. Проведение
Для эффективного осуществления ПЦР 3'-концевой нуклеотид праймера должен быть комплементарен соответствующему нуклеотиду матричной ДНК. В противном случае эффективность удлинения праймера во время ПЦР резко снижается и при определенных сочетаниях ошибочно спаренных нуклеотидов может отсутствовать вообще. Именно эта особенность ПЦР и лежит в основе метода обнаружения мутаций с помощью аллель-специфической ПЦР, иначе называемой аллель-специфической элонгацией праймера ( allele specific primer extension ).
Другой тип универсальных аллель-специфических праймеров содержит 3'-концевой нуклеотид, всегда некомплементарный матрице, а мутантный нуклеотид матрицы попадает в его внутреннюю часть (см. рис. II.34,а,в ). В этом случае продукты ПЦР отсутствуют, если в гибриде во внутреннюю часть праймера попадает любой некомплементарный мутантный нуклеотид матричной ДНК вне зависимости от его точной локализации. Такие праймеры позволяют обнаруживать любые точковые мутации в гомозиготном состоянии и у гаплоидных микроорганизмов. Для выявления гетерозиготного состояния анализируемого гена иногда используют мутантный и нормальный праймеры разных размеров, которые различаются по длине их 5'-концевых последовательностей, полностью комплементарных анализируемой ДНК. В этом случае в процессе ПЦР в реакционную смесь можно одновременно добавлять оба аллель-специфических праймера: мутантный и нормальный вместе с общим для обоих праймеров - встречным. Образовавшиеся продукты реакции, соответствующие мутантному аллелю и аллелю дикого типа, далее разделяют электрофоретически в гелях, используемых для секвенирования нуклеиновых кислот.
При использовании аллель-специфических праймеров для обнаружения мутаций необходимо иметь в виду, что не все сочетания ошибочно спаренных с матрицей 3'-концевых нуклеотидов одинаково эффективны в блокировании ПЦР. Наименьшей способностью к элонгации праймеров с ошибочно спаренными 3'-концевыми нуклеотидами обладает так называемый фрагмент Шоффлера Taq-полимеразы , который представляет собой молекулу ДНК-полимеразы T.aquaticus, укороченную с N-конца на несколько десятков аминокислотных остатков. В то же время в этом методе не применимы термостабильные ДНК-полимеразы, обладающие 3'->5'-корректирующей активностью, например Vent-полимераза.
Детекция продуктов пцр
Детекция продуктов пцр проводится с применением вертикального и горизонтального электофореза. Большое влияние на эффективность амплификации оказывает степень чистоты препарата ДНК, т.е. наличие в реакционной смеси тех или иных ингибиторов, от которых избавиться в некоторых случаях бывает крайне сложно. Иногда, из-за их присутствия не удается амплифицировать даже десятки тысяч молекул ДНК-мишени. Таким образом, прямая связь между исходным количеством ДНК-мишени и конечным количеством продуктов амплификации часто отсутствует.
Результаты амплификации оценивались путем проведения горизонтального электрофореза (камера и блок питания Peqlab) в 3% агарозном геле в однократном TRIS-борат-ЭДТА буфере (1xTBE).
Оптимальным было использование тринадцатилуночных гребёнок: в один гель вносились до 11 образцов (анализировалось до одиннадцати человек за один раз), в двенадцатую лунку обычно вносился маркер молекулярного веса («Праймтех», РБ), который позволяет определять молекулярный вес ампликонов.
Время проведения электрофореза зависит от молекулярной массы амплифицированного продукта. Но в случае ПЦР - КДПП этот показатель не является критичным. Время электрофореза составляло в среднем 60 минут.
Анализ гелей проводился с помощью трансиллюминатора CN-1000 Darcroom (Vilbcr Lourmal, Германия) с оригинальным программным обеспечением.
Для детекции ДНК-амплификатов в ультрафиолете (λ=260нм) использовали 0,1% раствор бромистого этидия в 1xTBE. Экспозиция геля в растворе перед анализом составляла 10-12 минут. Дальнейший денситометрический анализ с помощью программы Vision-Capt определил это время как оптимальное. С помощью расширенных функций данной программы можно было определять молекулярную массу продукта амплификации, корректировать изображение в реальном времени (благодаря высокочувствительной фотокамере, ассоциированной непосредственно с трансиллюминатором), фотографировать и сохранять изображение для последующего его анализа.