Ферменты обладают специфичностью действия

Лекция № 10.

ТЕМА «ФЕРМЕНТЫ».

  1. Химическая природа ферментов, их биологическая роль.
  2. Отличие ферментов от неорганических катализаторов
  3. Специфичность действия ферментов, её типы.
  4. Гипотезы фермент-субстратного взаимодействия.
  5. Изоферменты, их биологическая роль и значение для лабораторной диагностики
  6. Кофермент, простетическая группа – роль в биологическом катализе, химическая природа, основные представители.
  7. Коферменты – производные витаминов (ТПФ, КоА, НАД, НАДФ, ФАД, ФМН, пиридоксальфосфат, ТГФК, кобаламины, карбоксибиотин – схема строения молекул, биологическая роль.

 

ФЕРМЕНТЫ (энзимы) – специфические белки, играющие роль биокатализаторов, т.е. ускорителей химических реакций.

Как белки ферменты имеют первичный, вторичный. Третичный и четвертичный уровни организации молекул. Первичная структура в значительной степени характеризует индивидуальность фермента. Вторичная структура ферментов организована в виде α-спирали. Третичная структура имеет вид глобулы и участвует в формировании активного и других центров фермента. Многие ферменты имеют четвертичную структуру и представляют собой объединение нескольких субъединиц, каждая из которых характеризуется тремя уровнями организации молекул. Эти субъединицы могут различаться между собой как в количественном, так и в качественном отношении. Эти различия привели к появлению групп родственных ферментов – изоферментов. Почти все ферменты функционируют внутри тех клеток, в которых синтезируются, за исключением ферментов органов пищеварения и отдельных энзимов плазмы крови. Биологическая роль ферментов в том, что

1-они действуют в строго определенной последовательности, катализируют расщепление молекул питательных веществ,

2-обеспечивают запасание и преобразование химической энергии,

3-из простых молекул – предшественников строят макромолекулы, входящие в состав клетки.

 

Ферменты имеют ряд особенностей в отличие от других катализаторов:

1) они по химической природе белки, высокомолекулярные полимеры;

2) имеют высокую специфичность действия и низкий температурный оптимум (25º − 40ºС);

3) «работают» в физиологических условиях рН среды при нормальном атмосферном давлении;

4) структура катализатора в ходе реакции может изменяться, а фермент если изменяется, то восстанавливаться по окончании реакции;

5) высокая скорость катализируемой реакции 108 – 1011 раз.

Активность ферментов меняется в зависимости от пола, возраста, физиологического состояния организма, что не свойственно неорганическим катализаторам.

В зависимости от химического состава ферментов различают – простые ферменты – состоят только из аминокислот. Это в основном гидролитические ферменты, встречающиеся в ЖКТ: пепсин, амилаза, липаза и др., и сложные ферменты – протеиды – имеют в своем составе и небелковую часть (кофермент). Молекула субстрата должна соединиться с определенным участком фермента, если фермент работает с коферментом, он должен связываться и с ним.

Специфическое строение фермента служит гарантией того, что соответствующие группы субстрата приходят в тесный контакт со строго определенным местом фермента. Этот участок по структуре соответствует молекуле субстрата и называется активным центром фермента.

Активный центр фермента образован:

Ø простые ферменты: функциональными группами боковых радикалов аминокислот, сближенных в пространстве;

Ø сложные ферменты: + кофактор.

Функциональными группами активного центра являются NН2 – лизин, ОН – серин, СООН – глутоминовая к-та, аспаргановая к-та, SН – цистеин.

Участки активного центра: − якорный – для фиксации субстрата; каталитический – обеспечивает катализ.

У ряда регуляторных ферментов имеется еще один центр – аллостерический, занимающий другое пространственное положение, чем активный центр. Присоединение к этому центру низкомолекулярных веществ (эффекторов) ведет к изменению третичной структуры фермента и области активного центра, что приводит к изменению активности фермента.

Образование фермент-субстратного комплекса протекает на I стадии ферментативной реакции и очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра.

В 1894 году Фишер предложил модель взаимодействия фермента с субстратом «ключ-замок», т.е. субстрат подходит к ферменту как ключ к замку. Согласно этой модели у фермента имеется окончательно сформированный активный центр еще задолго до взаимодействия с субстратом. Эта модель объясняла абсолютную специфичность фермента и не могла объяснить относительной, поэтому Кошланд предложил модель «индуцированного соответствия», согласно которой, окончательное формирование активного центра фермента происходит в момент взаимодействия с субстратом, т.е. при связывании субстрата с якорным участком активного центра происходит изменение конформации каталитического участка активного центра, обеспечивающее его комплементарность поверхности субстрата.

Ферменты обладают специфичностью действия.

Различают 4 вида субстратной специфичности:

  1. Абсолютная – фермент катализирует превращение строго определенного одного субстрата. Например, аргиназа расщепляет аргинин, амилаза – крахмал.
  2. Относительная – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих один тип связи. Например, липаза расщепляет сложноэфирную связь между глицерином и любой жирной кислотой в ТАГ.
  3. Относительная групповая – фермент катализирует превращение нескольких субстратов, имеющих один тип связи, но требуются определенные атомные группировки, образующие эту связь. Например, все протеазы расщепляют пептидную связь, а пепсин расщепляет связь, образованную – NН2 группами ароматических аминокислот, трипсин – пептидную связь, образованную –СООН группой лизина, аргинина.
  4. Стереохимическая – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии их смеси. Например, L оксидаза превращает L аминокислоту, но не действует на Д-изомер.

 

Хотя фермент обычно катализирует одну реакцию, в организме имеются белки, которые катализируют схожие реакции. Такие белки, которые обладают способностью катализировать одинаковые реакции, но отличаются физико-химическими и биохимическими параметрами (электрофоретическая подвижность, рН-оптимум, чувствительность к ингибиторам) относят к множественным формам ферментов. Различают два основных вида множественных ферментов. Один вид называют изоферментами – это молекулярные формы ферментов, синтез которых контролируется различными генами, а следовательно, первичные структуры их различны, различаются также по аминокислотной последовательности, молекулярной массе, аминокислотному составу и др. Например, окисление молочной кислоты (лактат) в организме катализирует фермент ЛДГ – лактатдегидрогеназа. Под ЛДГ понимают 5 различных ферментов, которые обознаются цифрами от 1 до 5 – ЛДГ1, ГДГ2, ЛДГ3, ЛДГ4, ЛДГ5. Большое число изоферментов обусловлено субъединичным их строением. Молекула ЛДГ состоит из 4 полипептидных цепей, формирующих четвертичную структуру фермента.

У человека синтезируются две разные по составу ЛДГ-полипептидные цепи, которые позволяют на уровне четвертичной структуры создавать пять различных комбинаций. Это их количество обусловлено наличием двух генетических локусов, которые кодируют синтез 2-х олигомеров субъединицы М (muscle) и субъединицы Н (heart). Комплексуясь в тетрамеры, субъединицы образуют 5 изоформ:

 
 


НННН – ЛДГ1

преобладают в сердце, мозге, почках.

НННМ – ЛДГ2

 

ННММ – ЛДГ3 − преобладает в легких.

 
 


НМММ – ЛДГ4

преобладают в печени и скелетной

ММММ – ЛДГ5 мускулатуре

Среди других ферментов, имеющих изоформы – это креатинкиназа (три изоформы), щелочная фосфатаза (2 изоформы) и др. Так как изоферменты имеют различную локализацию в тканях, то это имеет важное значение для диагностики различных заболеваний. У больных острым инфарктом миокарда резко повышается активность ЛДГ1 и отчасти ЛДГ2.

> 1

При болезни Боткина резко возрастает активность ЛДГ5 и ЛДГ4 и уменьшается активность ЛДГ1 и ЛДГ2.

При мышечной дистрофии заметно снижается активность ЛДГ4 и ЛДГ5 и повышается активность ЛДГ1, ЛДГ2, ЛДГ3.

При патологии легких происходит «выход» фермента в ткани, что обусловливает повышение активности ЛДГ3 в сыворотке крови.

Некоторые ферменты требуют для работы дополнительные небелковые соединения. Небелковые компоненты в составе ферментов называют коферментами, а сам белок – апоферментом. Кофермент с апоферментом образуют холофермент. Такие двухкомпонентные ферменты обычно катализируют определенные типы реакций (дегидрирование, декарбоксилирование и т.д.). В одном типе реакций принимает участие один кофермент или строго ограниченное их количество. Кофермент во время реакции изменяется, он легко отделяется от белка. Если небелковая часть прочно вязана с апоферментом ковалентной связью и в качестве небелковой части выступают металлы она называется простетической группой. Кофермент – небелковая часть, легко отделяемая от апофермента, рыхло связанная с ним. Часто коферментами служат витамины. Общий принцип реакции, в которой участвует кофермент, состоит в том, что часть молекулы субстрата или целая молекула субстрата переносится на кофермент. Затем перенесенная группа вступает в реакцию с новым субстратом. При этом кофермент возвращается в исходное состояние. Переносимые группы могут быть простыми молекулами (Н2, СО2) или остатками более сложных соединений. В случае переноса водородов при помощи пиридиновых и флавиновых коферментов это выглядит как на схеме:

 

R-Н2 кофермент R1-Н2

 

R кофермент Н2 R1

 
 


На основании легкой подвижности этот кофермент соединяет два апофермента, причем один апофермент имеет окисленную форму кофермента, второй – восстановленную форму кофермента. Подобный пример имеет место в цепи ферментов тканевого дыхания

(ФАД + 2Н ↔ ФАДН2).

окисленная восстановленная

форма форма

Роль коферментов могут выполнять различные соединения: коферменты –нуклеотиды, коферменты – металлы, коферменты – производные водорастворимых витаминов, липоевая кислота, убихинон. Особо важное значение имеют коферменты – производные водорастворимых витаминов, так как протекание реакций, катализируемых ферментами с такими коферментами, зависит от поступления витаминов с пищей.

Коферменты, содержащие тиамин, образуются путем фосфорилирования витамина В1. Хорошо установлена роль тиаминдифосфата, известного также под названием тиаминпирофосфат (ТПФ), или кокарбоксилаза. Он участвует в реакциях простого окислительного декарбоксилирования альфа-кетокислот, входит в состав транскетолазы (пентозофосфатный путь окисления глюкозы).

Коферменты, содержащие пантотеновую кислоту (витамин В5). Пантотеновая кислота входит в состав кофермента А (КоА-SН). Этот кофермент участвует в реакциях переноса остатка кислоты (ацила). Наиболее значим в клетках остаток уксусной кислоты – ацетил. Ацетил – кофермент А (СН3-СО~S-КоА) – это сединение, которое объединяет между собой обмен разных веществ в клетке.

Коферменты, содержащие витамин РР (никотинамид, витамин В3). Витамин РР входит в состав НАД и НАДФ, которые входят в состав дегидрогеназ, катализирующих окислительно-восстановительные реакции. Они выполняют роль промежуточных акцепторов электронов и протонов.

Коферменты, содержащие рибофлавин. Они образуются путем фосфорилирования или аденилирования витамина В2. Различают 2 кофермента, содержащих рибофлавин – ФМН и ФАД – они участвуют в окислительно-восстановительных реакциях. Коферменты образуются путем фосфорилирования двух производных пиридина – пиридоксаля и пиридоксамина. Ведущим коферментом является пиридоксальфосфат, участвующий в реакциях трансаминирования, декарбоксилирования и др.

Коферменты, содержащие витамин Вс (фолиевая кислота), в своем составе витамин Вс содержит еще один витамин – парааминобензойную кислоту, которая соединяется с птеридином и глутаминовой кислотой. Коферментной формой является тетрагидрофолиевая кислота, которая участвует в реакциях переноса фрагментов органических молекул, содержащих один углеродный атом, необходимых для синтеза нуклеотидов, аминокислот, липидов.

Коферменты, содержащие витамин В12, который входит в состав коферментов – метилкобаламин и 5′-дезоксиаденозилкобаламин. Метилкобаламин участвует в реакциях переноса метильных групп, которые становятся важными источниками одноуглеродных фрагментов, а 5′-дезоксиаденозилкобаламин участвует в реакциях изомеризации.

Биотин (витамин Н) образует активную форму – карбоксибиотин, который участвует в реакциях карбоксилирования и транскарбоксилирования.

 

Лекция № 11.

ТЕМА «ФЕРМЕНТЫ».

  1. Кинетика ферментативных реакций:

- активность фермента, способы её выражения, клиническое значение её определения;

- влияние рН, температуры, концентрации субстрата и количества фермента на активность фермента;

- графический способ выражения. Константа Михаэлиса.

  1. Регуляция активности ферментов:

- эффекторы;

- ключевые реакции;

- индукция.

Роль гормонов как биологических регуляторов активности ферментов.

  1. Типы торможения. Аллостерическая регуляция. Принцип обратной свзи.
  2. Химическая модификация ферментов. Вспомогательные ферменты. Каскадные реакции.

 

Химическая реакция – это результат столкновения молекул, который зависит от величины энергии молекул и от прочности той связи между атомами в молекуле, которая должна быть разорвана. Молекул с очень низкой и очень высокой энергией мало, большинство молекул обладает средним запасом энергии. Они определяют скорость реакции.

Способы выражения химической реакции:

1) увеличить среднюю энергию молекул;

2) снизить энергетический барьер реакции.

 

Энергетический барьер реакции – это значение энергии, когда все молекулы взаимодействуют.

Энергия активации – количество энергии, необходимое для того чтобы все молекулы смогли провзаимодействовать (преодолеть энергетический барьер).

 

В общем виде уравнение химической реакции в присутствии фермента можно записать:

Е + S ↔ ЕS ↔ ЕZ → ЕР → Е + Р, где

Е – фермент,

S – субстрат,

Р – продукт,

Z – промежуточный комплекс.

 

Ферментативная реакция протекает в три стадии:

I стадия: Е + S ↔ ЕS – образование фермент-субстратного комплекса, протекает очень быстро. Субстрат присоединяется к якорному участку активного центра.

Причины ускорения реакции на I стадии: 1) происходит сближение и правильная ориентация молекул субстрата в области активного центра фермента; 2) это приводит к увеличению эффективной концентрации молекул субстрата.

 

II стадия: на стадии фермент-субстратного комплекса происходит химическая реакция через переходное состояние ЕS ↔ ЕZ, где Z – это уже не субстрат, но еще и не продукт. Именно эта стадия лежит в основе субстратной специфичности фермента. На этой стадии происходит ускорение реакции вследствие уменьшения энергии активации.

Причины снижения энергии активации: 1) фермент передает часть своей энергии субстрату в ходе взаимной подгонки конформации субстрата и фермента. Субстрат в ходе взаимодействия с активным центром фермента деформируется, что облегчает разрыв его связей; 2) уменьшается энергетический барьер в реакции путем разбивки её на ряд промежуточных стадий, каждая из которых имеет низкий энергетический барьер.

 

III стадия: ЕР → Е + Р происходит очень быстро, выделяется продукт реакции, а фермент выделяется в неизменном количестве и качестве.

Кинетика изучает механизм ферментативных реакций. Изучение ферментативной кинетики дает возможность составить представление о механизмах регуляции физиологических реакций. Знание кинетики ферментативных реакций важно для проведения ферментативной реакции в клинической лаборатории, для диагностики заболевания, контроля проводимого лечения.

Активность ферментов отражает скорость ферментативной реакции. В общем виде под активностью понимают количество фермента или биологического материала, содержащего фермент, которое при определенных условиях катализирует в единицу времени определенное количество субстрата. Активность – это изменение субстрата под влиянием фермента в единицу времени. Под изменением субстрата понимают снижающееся в единицу времени количество субстрата или же увеличивающееся количество продукта. Понятие «активность фермента» идентично понятию «скорость ферментативной реакции». Ферментативная активность выражается в единицах активности. Интернациональная единица активности обозначается «И» (unit – единица) и определяется как 1 мкмоль субстрата в 1 минуту. В системе СИ используют «катал» (kat, кат) в качестве единицы ферментативной активности. Катал определяется как 1 моль/сек. Размерность ее слишком велика, на практике пользуются меньшими кратными значениями, начиная с нанокатала (10¯9 кат). В сравнении с международной единицей: 1 И = 16,67 нкат.

В лабораторной практике пользуются понятием удельная активность. При этом число стандартных единиц пересчитывают на какую-либо единицу сравнения (мг, объем). Активность ферментов можно регулировать. При изучении действия ферментов в пробирке (in vitro) было отмечено, что оптимальные условия его работы тесно вязаны с различными факторами – рН, температурой, концентрацией субстратов и др.

 

Концентрация субстрата.

В 1913 году Михаэлис и Ментен показали, что скорость ферментативной реакции изменяется не пропорционально концентрации субстрата. При увеличении концентрации субстрата и постоянной концентрации фермента скорость вначале увеличивается линейно (а – реакция первого порядка), затем переходит в реакцию смешанного порядка (в), затем стремиться к максимальной скорости (с – реакция нулевого порядка).

Это означает, что при небольших концентрациях субстрата S отмечается прямая зависимость между концентрацией субстрата и активностью фермента (реакция I порядка). Повышение концентрации ведет к повышению активности. При дальнейшем повышении имеет место все большее отклонение от прямой зависимости, прирост активности отстает от прироста субстрата. Дальнейшее повышение концентрации субстрата до Smax ведет к тому, что скорость реакции достигает максимума (Vmax) и далее не увеличивается, т.е. активность фермента уже не зависит от концентрации субстрата (реакция нулевого порядка).

 

с

VMAX

 

в

 

VMAX/ 2

а

 

 
 


Km [S]

 

 

Константа Михаэлиса (Кm).

В случае, когда все активные центры заняты и свободные молекулы фермента отсутствуют, V0 = Vmax. При таком условии говорят о 100% насыщении. При 50% насыщении, когда V0 = ½ Vmax, из уравнения Михаэлиса-Ментен следует: или, в преобразованном виде, . Следовательно, Кm имеет размерность концентрации. Таким образом, Кm – это такая концентрация субстрата, которая необходима для связывания половины имеющегося фермента и достижения половины максимальной скорости. Из этого определения следует, что Кm можно использовать для оценки сродства фермента к данному субстрату.

Чем выше Кm, тем больше надо субстрата для достижения максимальной скорости. Если для достижения ½ Vmax требуется мало субстрата, то величина Кm будет мала. Величина Кm большая – низкое сродство субстрата к ферменту, Кm малая – высокое сродство субстрата к ферменту.