Метод молекулярной гибридизации
Метод молекулярной гибридизации (ДНК-гибридизация, ДНК-зонды) широко применяется для диагностики инфекционных болезней, в генетике, криминалистике и т.д. Метод основан на уникальном свойстве генетического материала организма – молекулы ДНК –, состоящей из мононуклеотидов, образовывать двойную спираль с комплементарно соединенными азотистыми основаниями. Известно, что молекула ДНК представляет полимер, состоящий из четырех видов дезоксирибонуклеотидов (dAMP, dGMP, dTMP, dCMP), соединенных между собой 3'- и 5'-фосфодиэфирными связями дезоксирибоз. Молекула ДНК образует двойную спираль, при которой азотистые основания первой цепи строго комплементарно соединяются водородными связями с азотистыми основаниями второй цепи, при этом аденин соединяется с тимином, гуанин с цитозином.
Принцип метода
Структуру двойной спирали ДНК (или РНК), скрепленную водородными связями, можно разрушить нагреванием, поскольку спаренные, не связанные между собой ковалентно, две полинуклеотидные цепи ДНК после разрыва всех водородных связей полностью разделяются.
Процесс разделения цепей называют денатурацией или плавлением ДНК. Денатурация происходит в узком интервале температур и сопровождается гиперхромным эффектом, т.е. при этом происходит возрастание поглощения ультрафиолетовых лучей. Температуру, при которой происходит разделение цепей ДНК, называют точкой плавления (Т пл.), которая в зависимости от состава ДНК имеет величину примерно 85-95о C. Процесс денатурации ДНК обратимый, т.е. при снижении температуры происходит восстановление водородных связей – отжиг – образование двойной спирали. Это явление называют ренатурацией (рис. 12.2.). Ренатурация связана со специфичностью спаривания азотистых оснований между комплементарными цепями. Реакция происходит в две стадии: вначале короткие комплементарные последовательности двух цепей случайно соединяются друг с другом и образуют двухспиральный участок, затем образуется длинная двухцепочечная структура с восстановлением первоначальных свойств, утраченных при денатурации.
В ренатурации участвуют две комплементарные последовательности. Если при этом взяты цепочки молекулы ДНК из различных источников, то говорят о гибридизации, например при отжиге ДНК и РНК.
В основе гибридизации лежит тот же принцип спаривания комплементарных оснований, который обеспечивает репликацию ДНК или ренатурацию молекул. Способность к гибридизации двух препаратов нуклеиновых кислот является строгим тестом на комплементарность их последовательностей.
Рис. 12.2. Схема денатурации и ренатурации ДНК; двойная спираль образуется по принципу комплементарности азотистых оснований.
а) нативная молекула ДНК,
б) денатурированная молекула ДНК,
в) ренатурированная молекула ДНК.
Способы гибридизации
Гибридизацию можно осуществлять в растворе или на фильтре (капроновом или нитроцеллюлозном). При гибридизации молекул в растворе препараты (одноцепочечные молекулы) смешивают и определяют образование двухцепочечных молекул при отжиге по изменению гиперхромного эффекта или же по количеству метки в двухцепочечной ДНК (для этого один из препаратов ДНК предварительно метят радиоактивным изотопом). Удобным для работы является метод гибридизации с использованием фильтров. При этом один из препаратов ДНК иммобилизуют на нитроцеллюлозных фильтрах, на которых молекула ДНК адсорбируется. Фильтры с адсорбированной одноцепочечной ДНК обрабатывают таким образом, чтобы предотвратить дальнейшую адсорбцию одноцепочечных молекул.
На рис. 12.3. показана схема гибридизации на фильтре.
Рис. 12.3. Схема гибридизации на фильтре.
А - иммобилизованная на фильтре одноцепочечная ДНК;
Б - одноцепочечная ДНК в растворе;
В - фильтр с иммобилизованной одноцепочечной ДНК опускается в раствор, содержащий денатурированную молекулу ДНК.
Фильтр с адсорбированной ДНК погружают в раствор, содержащий второй препарат денатурированной ДНК (ДНК-зонд). Связывание ДНК-зонда происходит только в том случае, если он имеет комплементарную последовательность с первоначально адсорбированной на фильтре молекулой ДНК.
Эффективность гибридизации определяют по количеству метки, оставшейся на фильтре. Метод является очень чувствительным и применяется для изучения структуры гена. При этом необходимо иметь меченые радиоактивным изотопом РНК или ДНК-зонды, идентификация которых с исследуемой молекулой регистрируется с помощью радиоавтографии.В качестве зонда используют клонированную кДНК-копию,т.е. меченую радиоактивным изотопом молекулу ДНК с известной последовательностью нуклеотидов.