Рекомбинантные молекулы и проблемы
Генной инженерии
Знание структуры молекулы ДНК, ее генетической роли, механизмов репликации ДНК и биосинтеза белка послужили основой развития новой науки – генетической инженерии. Ряд достижений молекулярной биологии и генетической инженерии воплощены в жизнь в области животноводства и ветеринарии: получены рекомбинантные вакцины против опасных инфекционных болезней животных, организовано производство гормона роста, интерферона, аминокислот, лекарственных веществ, разработаны методы ДНК-зондирования, полимеразной цепной реакции и т.д.
В связи с этим рассмотрим основные этапы получения рекомбинантных молекул и использования их для решения проблем ветеринарии. Для манипуляции с генами их получают следующими способами:
• методом химико-ферментативного синтеза;
• синтезом ДНК-копий с помощью обратных транскриптаз;
• выделением из фрагментированной молекулы ДНК.
Последний способ получения гена широко применяется, так как сейчас имеется большой набор ферментов-рестриктаз, так называемых «генных ножниц», позволяющих разрезать молекулу ДНК в определенных участках и выделить необходимый ген.
Следующий элемент – это векторные молекулы, так называемые генетические векторы. Векторные молекулы ДНК, способны перенести в клетку чужеродную ДНК и обеспечить там ее размножение (амплификацию) или включение в геном клетки.
В качестве вектора используют ДНК плазмид, ДНК-фагов, ДНК вируса оспы, ДНК других вирусов и некоторых бактерий. Например, для получения рекомбинантной молекулы ДНК вируса осповакцины, ее разрезают, с помощью рестриктаз и в несущественную часть генома осповакцины вставляют ген, интересующий исследователя. Так, получены рекомбинантные вакцины против чумы крупного рогатого скота, против бешенства, классической чумы свиней и т.д.
Создана рекомбинантная вакцина на основе вируса оспы, содержащего ген антигена вируса чумы крупного рогатого скота. При введении этой вакцины в организме животного образуются антитела, защищающие его от чумы крупного рогатого скота. Вакцину можно применять путем скарификации, что облегчает процедуру вакцинации. Она оказалась дешевле классической. Получена рекомбинантная вакцина против бешенства на основе вируса осповакцины. Она проверена на 30 видах животных с хорошим результатом. Подобная же вакцина создана против классической чумы свиней. При иммунизации этой вакциной образуются нейтрализующие антитела, защищающие животных от этой инфекции.
Создана вакцина на основе генома вируса болезни Ауески (ДНК-вирус), в который включен ген антигена вируса классической чумы свиней (РНК-вирус). Это крупный успех в получении вакцины против двух инфекций одновременно. В качестве векторной молекулы используются ДНК и других вирусов и бактериальных клеток. Является привлекательным использование в качестве основы вакцинного штамма M.bovis БЦЖ. В геном БЦЖ вставляют ген специфического антигена вирулентного штамма. Так созданы новые вакцины против туберкулеза, более эффективные по сравнению с БЦЖ.
Кольцевидная ДНК плазмид использована для получения рекомбинантных молекул с целью прризводства гормона роста. При этом ген гормона роста вставляется в кольцевидную ДНК плазмид и далее эта рекомбинантная молекула вводится в клетку кишечной палочки (E.coli), где в процессе ее жизнедеятельности рекомбинантная молекула экспрессируется, т.е. размножается и соответственно синтезируется гормон роста. Затем этот гормон выделяют из среды выращивания E.coli и применяют для стимуляции роста откормочных бычков или же для усиления молокоотдачи дойных коров. Гормон вводят 1 раз в месяц. Он обеспечивает стимуляцию продуктивности на 20%.
Таким же способом производят интерферон – белок, обеспечивающий защиту организма от вирусных инфекций, ряд других лекарственных препаратов.
Генная терапия – находится на стадии становления. В настоящее время имеются попытки лечения генетических болезней. Например, лейкоциты, извлеченные из крови больного, культивируют in vitro и с помощью ретровируса вносят в них дефицитный недостающий ген. Затем эти нормальные лейкоциты возвращают в организм больного. Так же поступают с клетками костного мозга: их культивируют in vitro, вносят недостающий ген с помощью ретровируса. Затем костномозговые клетки возвращаются в организм.
Антисмысловые РНК и ДНК используют для создания трансгенных животных. Антисмысловые соединения – это короткие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК (и-РНК), но с обратной последовательностью. Это соединение связывается с нуклеиновыми кислотами по тому же принципу, как при транскрипции – комплементарно, и затем блокирует синтез белка: трансляция не происходит. Если это антисмысловая ДНК, то она может задержать транскрипцию. Практическое выполнение заключается в том, что у больного берут костный мозг, и клетки костного мозга культивируют in vitro, обрабатывая антисмысловой ДНК, в таких условиях больные клетки погибают, и культура клеток получается здоровой. Параллельно с этим больного лечат облучением – убивают клетки костного мозга. После этого пересаживают здоровые клетки (его же), полученные из культуральной клеточной линии.
Сейчас усиленно изучается эффективность антисмысловых олигонуклеотидов – цепочек ДНК и РНК – ингибиторов при различных заболеваниях. При этом они должны обладать специфичностью, т.е. быть комплементарными к гену данного возбудителя или этиологического фактора. В этом плане имеются определенные успехи: созданы антисмысловая РНК вируса лейкоза крупного рогатого скота, аденовируса, парвовируса. На основании их получены трансгенные животные.
Трансгенез– перенос генов с целью изменения наследственных свойств животных, например путем переноса гена гормона роста. Животное, которое содержит в своем геноме чужой ген (трансген), называется трансгенным. Для переноса гена животных используют метод микроинъекции, ретровирусов и перенос стволовых клеток. Суть методов заключается в следующем:
Метод микроинъекции ДНКв пронуклеус зиготы – основной метод получения трансгенных животных. Метод разработан Дж. Гордоном (1980 г.).
В зиготу, фиксированную под микроскопом, вводят рекомбинантную молекулу ДНК, содержащую 100 и более копий гена. Далее зиготу трансплантируют самке – реципиенту. На мышах получены трансгенные особи, содержащие ген интерферона, гормона роста, гемоглобина человека, кролика, аденовируса, тимидинкиназы.
Использование ретровирусов в качестве векторов.Ретровирусы – это РНК-содержащие вирусы, которые с помощью фермента обратной транскриптазы синтезируют в клетке ДНК. В клетке синтезируется двухцепочечная ДНК, содержащая
генетическую информацию вирусной РНК. Такая ДНК интегрируется в хромосомную ДНК клетки, образуя провирус.
Инъекция трансформированных эмбриональных стволовых клеток в эмбрион.Стволовые клетки способны делиться и дифференцироваться. Их умеют выделять и размножать в культуре. В выделенные клетки можно инъецировать генные конструкции. Затем стволовые клетки включают в реципиентный бластоцит.
Трансгенез осуществлен на лабораторных (мыши, крысы) и сельскохозяйственных (овцы, свиньи, кролики, коровы) животных (Халитер и др., 1985 г; Крамер и др., 1986 г.).
Мышам в пронуклеус оплодотворенной клетки инъецировали микрошприцом ген интерферона, гормона роста, гемоглобина человека, кролика, аденовируса. Экспрессию гена гормона роста проверяли по живой массе, методом ДНК-гибридизации, полимеразной цепной реакции и т.д. Наиболее доступным объектом для биотехнологии являются кролики; связано это с тем, что экспрессия чужеродного гена осуществляется в них наиболее часто – 25% случаев. Получены трансгенные овцы (1985г, Австралия) с геном гормона роста; живая масса их была в 1,5 раза выше контрольных животных.
Трансгенез представляет интерес, прежде всего, для получения животных, в качестве продуцентов биологически активных веществ и лечебных препаратов. Например, трансгенных животных используют для продуцирования человеческого инсулина, фактора свертываемости крови, интерферона. Ведутся исследования по получению трансгенных животных, устойчивых к ряду заболеваний (гриппу, лейкозу и т.д.), многоплодных с улучшенными хозяйственными признаками.
Клонирование животных
Под клоном понимают генетически однородные потомкиодной исходной особи, образующиеся в результате бесполого размножения.
Для создания генетических копий сельскохозяйственных животных методом клеточной инженерии разрабатываются способы клонирования: пересадка ядер соматических клеток в яйцеклетку с предварительно удаленным ядром. Для этого берут от донора стволовые (не прошедшие дифференцировку) клетки. Ядро стволовых клеток in vitro вводят в энуклеированные яйцеклетки реципиента. Полученные таким способом зиготы крупного рогатого скота можно культивировать in vitro до 8-, 16-ти даже 32-клеточной стадии. Таких эмбрионов, достигших завершающих стадий предимплантационного развития, можно не только трансплантировать коровам-реципиентам или замораживать для длительного хранения, но использовать для последующего клонирования. Таким образом, можно в условиях in vitro получать неограниченное количество эмбрионов. Метод клонирования животных является очень привлекательным для получения неограниченно большого количества копий от высокопродуктивных особей, а потому разрабатывается очень интенсивно.
Достижения молекулярной биологии по изучению роли нуклеиновых кислот в процессах жизнедеятельности привели к разработке совершенно новых методов диагностики болезней животных и человека на основе уникальных свойств ДНК и РНК. Это – методы молекулярной гибридизации и полимеразной цепной реакции.