I. Теоретическая часть. Принцип полимеразной цепной реакции был сформулирован в 1983 г Kary Mullis, работавшим в ДНК-полимеразами термофильных бактерий
Принцип полимеразной цепной реакции был сформулирован в 1983 г Kary Mullis, работавшим в ДНК-полимеразами термофильных бактерий. Температурный оптимум для термофильных бактерий находится в пределах 56 - 100 °С и все ферменты, контролирующие процессы репродукции обладают термостабильностью . Это позволило Kary Mullis предположить, что добавление термостабильных полимераз к реакционной смеси из нативной ДНК, праймеров и нуклеотидов позволит осуществить синтез ДНК эукариотических клеток в искусственных условиях.
ПЦР - это метод ферментного синтеза определенных последовательностей ДНК in vitro. В реакции используются 2 олигонуклеотидных праймера (forward и reverse), которые гибридизируют противоположные участки цепей ДНК, подлежащей амплификации. Элонгация праймеров катализируется термостабильной ДНК-полимеразой (так называемой Taq-полимеразой). Попеременный нагрев и остывание смеси способствует денатурации нативной ДНК и отжигу праймеров, элонгации праймеров полимеразой и экспоненциальному накоплению специфических фрагментов ДНК (схема 1).
| Реакционная смесь |
¯
| нагрев реакционной смеси до 95 °С, происходит расщепление нитей нативной ДНК |
| нагрев до 72 °С, ДНК-полимераза активируется, способствуя надстройке комплементарных нитей от стартовых точек - праймеров |
| охлаждение реакционной смеси до 55-60 °С, праймеры связываются с комплементарными участками нитей ДНК |
| ® |
¯
число копий нативной ДНК удваивается с каждым циклом
Схема 1. Механизм полимеразной цепной реакции
Для проведения ПЦР требуется специальное оборудование:
1) Thermocycle - прибор с автоматизированным изменением температуры. В нем есть специальная камера для помещение пробирок (объемом 0,2 мл) с реакционной смесью (обычно на 24 пробы), компьютерная система для изменения температуры воды, с помощью которой осуществляется нагрев и охлаждение реакционной смеси;
2) вся реакция проводится в условиях стерильности или близким к ней, обычно для этой цели используют ламинарные боксы;
3) центрифуги для микропробирок,
4) шейкер с возможностью изменения температуры (для выделения ДНК),
5) автоматические дозаторы.
Сейчас имеются и полностью автоматизированные анлизаторы ПЦР, в которых производится автоматическое смешивание ингредиентов и даже предварительное выделение ДНК. Этими системами вследствие их высокой стоимости пользуются в основном диагностические учреждения, в которых проводятся скрининговые исследования.
Дополнительно требуется оборудование для детекции результатов ПЦР (установка для электрофореза и проч.), а также установки для дальнейшего анализа нуклеотидных последовательностей участков ДНК.
Праймеры готовят по заказу исследователей на предприятиях биотехнологии и молекулярной биологии. Для этого отправляют пропись обоих праймеров (т.е. указывают точную нуклеотидную последовательность). Изготовление праймеров проводят с помощью той же ПЦР из еще более мелких олигонуклеотидов, а их получают путем простейшего химического синтеза. Аналогичными фирмами выпускаются также и нуклеотиды (dNTP): каждый вид в отдельности или сразу смесь всех четырех. Праймеры для диагностики инфекционных заболеваний изготавливают в виде тест-систем для проведения диагностической ПЦР.
Для проведения ПЦР необходимо выделение нативной ДНК из материала для исследования. Чаще всего в качестве материала для диагностики инфекционных заболеваний используют плазму крови, либо клеточную часть крови. А выделение ДНК проводят с помощью специальных фирменных наборов. Выделение проводят в несколько стадий: лизис клеток (лизирующий раствор содержит ЭДТА и протеиназу К), солюбилизацию ДНК на специальной мембране, отмывание пробы от остатков клеточных структур, элюирование ДНК из мембраны.
Индикация продукта ПЦР проводится методом электрофореза в агарозном геле. В агарозу вносят этидиум-бромид, который связывается с ДНК и при облучении УФ-лучами визуализируются полосы продукта ПЦР. При необходимости забирают кусочки агарозного геля из мест расположения амплификатов, элюируют продукт ПЦР и изучают др. методами.