Качественное определение активности сукцинатдегидрогеназы

Сукцинатдегидрогеназа (1.3.99.1.) катализирует окисление сукцината до фумарата. Кофактором фермента является ФАД - флавинадениндинуклеотид.

Реакция, катализируемая сукцинатдегидрогеназой, характеризуется абсолютной стереоспецифичностью элиминирования водорода, так что отщепляются исключительно атомы водорода в транс - положении. Если бы подобная специфичность не существовала, образовалась бы смесь (50:50) двух изомерных ненасыщенных дикарбоновых кислот; малеиновой (цис) и фумаровой (транс). Однако образуется только фумаровая кислота:

FАD FАDН2

Н Н   НООС Н Н Н
½ ½ сукцинат- \ / ½ ½
НООС ¾С¾С¾СООН ¾¾¾¾> С= С + С = С
½ ½ <¾¾¾¾ / \ ½ ½
Н Н дегидроге наза Н СООН НООС СООН
        фумаровая к-та малеинова к-та
        (транс) (цис)
        образуется не образуется

é Цис и транс изомеры получились бы совместно,ù

ë если реакцияидет неспецифична û

Среди ферментов цикла лимоннонной кислоты сукцинатдегидрогеназа занимает особое место, поскольку локализована в митохондриальной мембране:

    О         ОН
    ||         |
    С         С
  / \       // \
  СI¾С С¾СI       СI¾С С¾СI
  || ||       | ||
  Н¾ С С¾Н       Н¾ С С¾Н
  \ /       \\ /
СООН   С     СООН   С
½   || сукцинатдегидро- ½   |
СН2 + N ¾¾¾¾¾¾¾> СН + N¾ Н
½   ½ геназа (скелетной ||   ½
СН2   С мышцы) СН   С
½ // \     ½ // \
СООН Н¾ С С¾ Н     СООН Н¾ С С¾ Н
  | ||       | ||
  Н¾ С С¾Н       Н¾ С С¾Н
  \\ /       \\ /
    С         С
    |         |
янтарная ОNа     фумаровая ОNа
кислота       кислота  
                 

окисленная форма восстановленная форма

(синий цвет) (бесцветная)

 

Принцип метода. В условиях опыта в качестве акцептора водорода при окислении сукцината используется 2,6 - дихлорфенолиндофенол, его натриевая соль.

В водном растворе окисленная форма 2,6 - дихлорфенолиндофенола окрашена в синий цвет. Восстановленная форма этого соединения - бесцветна. Активность сукцинатдегидрогеназы мышц обнаруживают, добавляя к мышечной кашице растворы янтарной кислоты и натриевой соли окисленной формы 2,6 - дихлорфенолиндофенола. Если сукцинатдегидрогеназа активна, интенсивность синей окраски ослабевается, благодаря бесцветной форме 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Ход работы. В две пробирки отмеривают по 3 мл фосфатного буфера с рН 7,4. В одну пробирку(опытную) добавляют 5 капель 5 %- ного раствора янтарной кислоты и (для нейтрализации) 5 капель 0,1 н. раствора едкого натра, в другую (контрольную) приливают 10 капель дистиллированной воды. В обе пробирки добавляют по 1 мл 0,001 н. раствора 2,6 - дихлорфенолиндофенола и по 50 мг хорошо измельченной мышечной ткани (свежей). Обе пробирки помещают на 20 мин. в термостат при 37 0С. Сравнивают интенсивность окрашивания в контрольной и опытной пробирках. Делают выводы и оформляют таблицу 2.

 

Таблица 2 - Основные параметры опыта и его результаты

№ опыта Субстрат Фермент Тип катализируемой реакции Условия проведения опыта (toС, рН, добавление др. реагентов) Наблюдения
           

 

Материалы и реактивы: экстракт мышечной ткани (см. Приложение В, п.3); фосфатный буфер, рН 7,4 (см. Приложение В, п.4); 5 % - ный раствор янтарной кислоты; 0,1 н. раствор NаОН; 0,001 н. раствор 2,6 - дихлорфенолиндофенола.

Оборудование: пробирки; пипетки; термостат.

 

Глюкозооксидаза (1.1.3.4)

Это двухкомпонентный фермент, содержащий в качестве простетической группы две молекулы флавинаденидинуклеотида (ФАД). Этот фермент катализирует дегидрирование глюкозы и перенос отнятого водорода на кислород воздуха с образованием пероксида водорода. При этом глюкоза превращается в глюконолактон:

СН2ОН       СН2ОН  
Н ½ О ОН       Н ½ О  
Н   + О2   Н С = О  
ОН Н ¾¾¾¾¾¾> ОН Н + Н2О2
НО Н       НО  
Н ОН       Н ОН  
           
b - D- глюкопираноза b - глюконолактон

В живых клетках и неочищенных ферментных препаратах, используемых в промышленности, глюкозооксидаза всегда присутствует с глюконолактоназой и каталазой, глюконолактон превращается в глюконовую кислоту:

 

СН2ОН   СН2ОН
Н ½ О   Н ½ ОН
Н С = О глюконолактоназа Н СООН
ОН Н +Н2О   ОН Н
НО   НО
Н ОН   Н ОН
     
глюконолактон D - глюконовая кислота

Пероксид водорода разлагается каталазой:

каталаза

2 Н2О2 ¾¾¾¾¾¾¾¾> 2 Н2О + О2

 

Так как очищенные препараты глюкозооксидазы взаимодействуют практически лишь с глюкозой, она является одним из важнейших ферментов, применяемых в пищевой технологии и клинической биохимии для определения сахара.

Глюкозооксидаза используется в пищевой промышленности как для удаления следов глюкозы, так и для удаления следов кислорода, при производстве сухого яичного порошка, пива, вина, соков, майонеза. Для удаления кислорода из продуктов, содержащих жир, упаковочный материал - синтетическую пленку - пропитывают глюкозооксидазой, глюкозой и буфером.