Определение активности каталазы по А. Н. Баху и А.И. Опарину
Принцип метода основан на учете изменения количества пероксида водорода, расщепляющегося под действием этого фермента, который определяется путем титрования перманганатом калия. Реакция идет по уравнению:
2 КМnО4 + 5 Н2О2 + Н2SО4 ¾® 4 КНSО4 + 2 МnSО4 + 8 Н2О + 5О2
О количестве перекиси водорода, разрушенной ферментом, судят по разности количеств мл 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованных для титрования в контрольном и рабочем опытах.
Ход работы. Отбирают две пробы прозрачного фильтрата или центрифугата по 20 мл каждая ( опытная и контрольная); последнюю кипятят 5 минут на сетке для инактивации фермента.
К пробам прибавляют по 20 мл дистиллированной воды, по 3 мл 1%–го пероксида водорода, предварительно нейтрализованного 0,1 н. раствором NаОН, и оставляют на 30 минут при комнатной температуре. Затем к пробам прибавляют по 5 мл 10% –ной серной кислоты и оставшийся пероксид водорода титруют 0,1 н. раствором марганцовокислого калия. Об активности каталазы судят по количеству миллиграммов перекиси водорода, которое разрушилось в течение 30 минут ферментом, содержащимся в 1 г исследуемого материала.
Активность каталазы Ек определяют по формуле:
(Vk - Vo) . 1,7
Еk = ¾¾¾¾¾¾ , (2)
n
где Ек – активность каталазы;
Vk – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного для титрования контроля, мл;
Vo – количество 0,1 н. раствора КМnО4, израсходованного на титрование рабочего опыта, мл (1 мл 0,1 н. раствора КМnО4 эквивалентен 1,7 мг Н2О2);
n – навеска исследуемого материала в титруемой пробе, г.
Материалы и реактивы: 1%–ный раствор пероксида водорода; 0,1 н. раствор марганцовокислого калия; 10 %–ный раствор серной кислоты; вытяжка из муки или другого растительного материала (см. Приложение В, п.8).
Пероксидаза (1.11.1.7)
Пероксидаза - это двухкомпонентный фермент состоящий из гема и гликопротеида. Она катализирует реакцию:
RООН + АН2 ¾¾¾¾> Н2О + RОН + А,
где в качестве RООН могут быть Н2О2 или органические пероксиды, т.е. она высокоспецифична в отношении акцептора водорода и совсем не специфична в отношении донора водорода (ими могут служить фенолы, амины и другие органические соединения, т.е. обладает широкой субстратной специфичностью).
Механизм действия пероксидазы можно представить следующим образом:
Пер(ОН) + Н2О2 Пер (ООН) + Н2О
Пер(ООН) + АН2 Пер (ОН) + Н2О +А
Пероксидаза с пероксидом водорода образует промежуточное комплексное соединение, в результате чего пероксид активируется и действует как акцептор водорода.
Действие пероксидазы может быть желательным при ферментации чая и табака, т. к. наряду с полифенолоксидазой она способствует образованию окрашенных и ароматизированных компонентов. В некоторых случаях действие пероксидазы нежелательно - так, для увеличения лежкости и сохранности перерабатываемых продуктов необходимо удалить или ингибировать пероксидазу вместе с полифенолоксидазой. Наиболее активна пероксидаза из корней хрена.