А. Реакции образования амидной связи

Присоединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему аген­ту (С) посредством амидной связи можно многими путями и при уча­стии различных функциональных групп. Наиболее часто применяют реакцию ацилирования аминогрупп фермента. В качестве ацилирую-щих агентов используются ангидриды.

NH-
ф
/

О
/С-Ох рН9'5
Н. O + HoN—Гф1------- ►Н—

С-0

соон

С помощью ангидридного метода получено более 20 новых препа­ратов иммобилизованных ферментов, таких, как пенициллинамидаза, пепсин и т. д. Носителями служат в основном сополимеры малеиио-вой кислоты с ненасыщенными соединениями — этиленом, акриловой кислотой — или сополимеры малеинового ангидрида.

Одним из вариантов ангидридного метода является использова­ние полимеров, содержащих ангидридные группы в качестве предше­ственников для получения носителей с разнообразными функциональ­ными группами.

В качестве ацилирующих агентов применяют также активирован­ные эфиры. Например, сополимеризацией 2-оксиэтилметакрилатана с производными метакриловой кислоты получают п-нитрифениловые эфиры полимеров типа «Сферой»:


НС


О

II

С-

НС


о


О с-


О-------- N02 + H2N---- \ф

-NH-

Ф +0


рН8

10 мин


Эта реакция интересна тем, что в процессе модификации белка высвобождается ион нитрофенила, по которому можно контролиро­вать ход реакции спектрофотометрическим методом.

Б. Реакции образования карбамидных связей (производные мочевины)

Изоцианаты способны эффективно взаимодействовать с различ­ными функциональными группами белков с образованием производ-


пых мочевины - диалкилмочевины, уретана, уреидов. Наиболее реак­ционными группами белков здесь являются аминогруппы:

рН8

НС—C-NH-
Ф
24 ч

НС —N = С = О + H2N------- |_Ф

О

Изоциаиаты используют для активации неорганических (гидро­окись титана, кремния, алюминия) и целлюлозных носителей. В пер­вом случае реакцию проводят в органическом растворителе, причем часть изоциаиатных групп образует с гидрооксидом карбонат, а остав­шиеся активные группировки могут реагировать в водном растворе с амиио- и гидрооксидными группами белка соответственно в щелоч­ных и слабощелочных средах. Таким образом были иммобилизованы глюкозоамилаза, лактаза и т. д.

Бромциаиовый метод — один из самых распространенных мето­дов химической иммобилизации ферментов. При обработке бромциа-пом на полисахаридиых носителях формируются реакционноспособ-ные цианатные, имидокарбопатиые группы. При взаимодействии фер­мента с образованным полисахаридом получаются изомочевипы и уре-таиы.

B2CN + Полисахарид ► Полиакриламид


Н


XX

^С =Nh + H2N-------- [Ф

чо


рН 4,7 4°С


 


Н —о

Он


NH 1| С—NH-

О


Ф


 


Н


\


-О — С—NH-ОН


Ф


Обработка неорганических носителей (стекло, оксид титана, оксид алюминия) также существенно повышает (в 10 — 15 раз) количество связанного фермента. Кроме того, увеличивается и время функциони­рования иммобилизованного фермента, например глюкозоамидазы.