В микроанализе. Биосенсоры

Современные прикладные и фундаментальные науки в своих ис­следованиях нуждаются в высокочувствительных, быстрых и эконом­ных методах анализа. Этого же требуют промышленные процессы, особенно биотехнологического профиля, где необходим точный техно-химический контроль.

Наряду с усовершенствованием различных физико-химических методов в последние годы разрабатываются и находят широкое при­менение те из них, где при анализе используются в качестве реагентов ферменты и другие биологические агенты для обнаружения разнооб-разных веществ.

Известно, что ферменты — это биологические катализаторы, обла-


дающие высокой специфичностью и ярко выраженной способностью избирательно катализировать многие химические превращения как в живой клетке, так и вне организма. Эти свойства ферментов давно привлекали внимание исследователей, в том числе аналитиков, но прак­тическому их применению, например для аналитических целей, пре­пятствовали прежде всего малая доступность чистых ферментов, неустойчивость во времени их растворов, препаратов при хранении и воздействии на них различных факторов (тепловых, химических), не­возможность многократного использования одной порции фермента из-за сложности отделения его от других компонентов раствора, высо­кая стоимость очищенных препаратов. Однако выход из положения вскоре был найден, и появилась возможность применения каталити­ческих свойств ферментов вне их связи с живым организмом и сохра­нения этой способности в течение длительного времени практически без изменения за счет перевода их в иммобилизованное (нераствори­мое) состояние. Достижения в этой области биохимии и энзимологии положили начало развитию нового направления аналитической хи­мии — безреагентных методов анализа, основанных на использова­нии различных биохимических сенсоров.

Биосенсор представляет собой устройство, в котором чувствитель­ный слой, содержащий биологический материал: ферменты, ткани, бак­терии, дрожжи, антигены /антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК, непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента, генерирует сигнал, функционально связанный с концент­рацией этого компонента. Конструктивно он состоит из двух преоб­разователей, или трансдыосеров, — биохимического и физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. На рис. 27 приведена общая схема такого устройства.

Биохимический преобразователь, или биотрансдыосер, выполняет функцию биологического элемента распознавания, преобразуя опре­деляемый компонент, а точнее, информацию о химических связях в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический пре­образователь это свойство фиксирует с помощью специальной аппа­ратуры. В данном случае реализуется принципиально новый способ получения данных о химическом составе раствора. Наличие в устрой­стве биоматериала с уникальными свойствами позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной по соста­ву смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связан­ным с использованием других реагентов, с концентрированием и т. д. (отсюда и название — безреагентные методы анализа).

Существует большое разнообразие физических трансдьюсеров: электрохимические, спектроскопические, термические, пьезоэлектриче­ские, траисдьюсеры на поверхностных акустических волнах и т. п. На рис. 28 приведен перечень преобразователей, используемых в биосен­сорах. В настоящее время наибольшее распространение получили электрохимические их виды. Одни из них генерируют потенциал на


специальном электроде, на поверхность которого нанесен слой биома­териала, другие генерируют электрический ток реакции продукта пре­вращения определяемого вещества на поверхности электрода, вы­званного биоматериалом. Другими словами, существуют потенцио- и амперометрические биосенсоры. Если физический преобразователь использует изменение светопоглощения в области биослоя, то такой биосенсор называется, например, оптоволоконным, поскольку измеря­емый сигнал будет передаваться измерительному прибору по опти­ческому волокну. Соответствующий физический преобразователь по аналогии с электродом называют оптродом. По названию преобразо-вателя можно сделать вывод о характере физического свойства, кото­рое измеряется аппаратно, причем, как правило, при этом использует­ся микропроцессорная техника (см. рис. 27), позволяющая сделать устройство достаточно компактным.


Схема ферментативной реакции

Е + S*=tES—-> Е + Р

Е — фермент, S — субстрат,

ES — промежуточный комплекс,

Р — продукт (фиксируется физи-

2 ческим преобразователем)


Рис. 27. Принципиальная схема биохимического сенсора: 1 — исследуемый раствор; 2 — корпус биосенсора; 3 — полупроницаемая мембрана (для механического удержания биослоя); 4 — слой биоматериала; 5 — физический

преобразователь (электрод, пьезокристалл, оптоволоконный материал и т. д.); 6 — усилитель сигнала; 7 — самописец (дисплей, цифровой или световой указатель)

Первое упоминание об аналитических устройствах на основе фер­ментов или ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х гг. прошлого столетия. Холинэстеразу, включенную в крахмальный гель и нанесенную на полиуретановую пластинку, ис­пользовали для обнаружения фосфорорганических инсектицидов в воздухе. Этот фермент очень чувствителен к фосфорорганическим со­единениям, легко ими ингибируется. После пропускания анализируе­мого воздуха через ферментный датчик измеряют остаточную актив­ность холинэстеразы. По разнице между исходной ее активностью и


активностью после контакта с воздухом по градуировочному графи­ку находят концентрацию этих токсичных соединений. В настоящее время иммобилизованная холииэстераза используется в автоматиче­ских датчиках в промышленном производстве инсектофунгицидов для постоянного контроля воздушной среды цехов. Затем в обиход вошло понятие «биосенсор», или «биочип». Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины, связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом, биосенсо­ры сопоставлены с датчиками живого организма — биорецепторами, способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей среды, в электрические.


Г

Биослой'

(биологический \ элемент распознавания)

V


Целые организмы

Живые ткани

Клетки

Органеллы

Мембраны клеток

Ферменты (индивидуальные)

Препараты ферментов

(неочищенные)

Рецепторы

Антитела

Нуклеиновые кислоты


Г


Физический преобразователь


<


Потенциометрические

Амперометрические

Кондуктометрические

Импедансометрические

Оптические (оптроды)

Акустические

Тепловые

Механические


> Электроды


V.

Рис. 28. Перечень преобразователей, используемых в биосенсорах

Принцип работы биосенсора достаточно прост. Определяемое ве­щество диффундирует через полупроницаемую мембрану в тонкий слой биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция по схеме, указанной на рис. 29. Поскольку в данном случае продукт этой реакции определяется с помощью электрода, на поверхности ко­торого закреплен фермент, то такое устройство еще называют фер­ментным электродом. Таким образом, понятия «биосенсор» и «фер-


ментный электрод» выступают в данном случае как синонимы. Боль­шинство ферментативных процессов взимосвязаны, т. е. продукт од­ной такой реакции является субстратом другой. Если трудно иденти­фицировать продукт, то берется другой фермент, который превратит его в легко определяемое вещество. С помощью таких сопряженных реакций можно даже увеличить чувствительность анализа.




Схема ферментативной реакции

На аноде: Н202

I тип био­сенсора

II тип био­сенсора


На катоде (физический трансдьюсер):

-*>40Н_

02 + 4е + 2Н20

Ферментативная реакция (биологический трансдьюсер):

Глюкозоксидаза

S(red) + 02 + Н20---------- ► S(ox) + Н202

(Глюкоза) (Глкжоновая

кислота)

-*02 + 2Н+ + 2е


Рис. 29. Схема работы глюкозного биосенсора:

1 — исследуемый раствор; 2 — корпус биосенсора; 3 — внешняя мембрана;

4 — слой глюкозоксидазы; 5 — внутренняя газопроницаемая мембрана;

6 — платиновый электрод (проволока) для восстановления кислорода;

7 — усилитель сигнала; 8 — самописец (дисплей, цифровой

или световой указатель и т. д.)

По-видимому, самым распространенным в настоящее время явля­ется амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глю­козоксидазы для определения сахара в жидкостях. В качестве физи­ческого трансдьюсера в нем использован так называемый электрод Кларка. В настоящее время для определения глюкозы создано наи­большее число различных биосенсоров, что связано с необходимостью


контроля за содержанием сахара в биологических жидкостях, напри­мер в крови, при диагностировании и лечении некоторых заболева­ний, прежде всего диабета. Схема воздействия биосеисора па глюкозу в принципе типична и для других амперометрических его видов с аналогичным трансдыосером (см. рис. 29). Ток восстановления на платиновом катоде кислорода прямо пропорционален его концентра­ции. В присутствии субстрата (например, глюкозы в крови, взятой для анализа) ферментативная реакция понижает концентрацию 02. Та­ким образом, ток восстановления кислорода уменьшается пропорцио­нально концентрации субстрата:

Глюкозоксидаза

Глюкоза + 02------------- ► Глюконовая кислота + Н2(Э2

Преимущество данного типа биосеисора, основанного на кислородном электроде Кларка, состоит прежде всего в его высокой селективности. Эта избирательность определяется особой специфичностью глюкозо-ксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют компоненты ферментативного процесса. В целом оксидазы являются высокоспецифичными по отношению к определяемым субстратам. Системы же на основе иебиологического преобразователя, напротив, не столь селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее имеются ограничения и по применению данной конструкции биосенсора, обусловленные влиянием кислорода и дру­гих посторонних веществ, способных проникать через биослой (точ­нее, через мембрану), а потому задача совершенствования конструк­ций глюкозных биосенсоров представляется весьма актуальной.

Один из возможных путей такого усовершенствования заключа­ется в следующем. Если изменить полярность включения электрода-трансдыосера в глюкозном биосенсоре на противоположную, т. е. плати­новый катод Кларка сделать анодом, то при потенциале +0,6 В он становится совершенно невосприимчив к кислороду, но зато дает от­клик на пероксид водорода, который при данном значении потенциала окисляется до воды. Эта чувствительность оказалась привлекатель­ной, а поскольку Н202 образуется как продукт ферментативной реак­ции, по его содержанию можно сделать вывод о концентрации, напри­мер, глюкозы в различных объектах. Другой способ улучшения селек­тивности биосенсоров и устранения помех от посторонних примесей состоит в использовании различных мембран — пленок, предотвраща­ющих попадание этих веществ непосредственно на электрод-преобра­зователь. При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защи­ты от примесей, а внешняя пропускает субстрат в биослой. Имеются и другие средства повышения избирательности физических преобразо­вателей, в данном случае электродов. Например, с помощью специаль­ных приемов, называемых химической модификацией, можно до такой степени изменить свойства поверхности электрода, что он будет «глу­хим» к большинству примесей и, напротив, чувствительным к компо­нентам ферментативной реакции. 244


Биосеисоры, основанные на кислородном электроде как физиче­ском трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме глюкозы еще и лактаты, L-аминокислоты, салици-латы, оксалаты, пируваты, т. е. анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие устройства подобного типа, ряд которых применяется на практике.

Для устранения влияния мутности и цвета исследуемых объектов на величину сигнала шведскими учеными был разработан микрокало­риметрический датчик на основе иммобилизованных ферментов (рис. 30).

_ . I самописец

термистор!—| самописец | ■ ■

I I

30 мм
а б

Рис. 30. Микрокалориметрический датчик для определения метаболитов: а — схема измерительного блока, где 1 — крепление колонки; 2 — металлический блок; 3 — термистор; 4 — микроколонка, заполненная иммобилизованным фермен­том; 5 — внутренняя часть блока; 6 — водяная баня; 7 — теплообменник; б — общая схема установки, где 1 — измерительная колонка с ферментом; 2 — теплообменник; 3 — колонка сравнения с ферментом; 4 — водяная баня

С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой определенной концентрации субстрата оценить активность собственно фермента по величине измеряемого сигнала (потенциала, тока и т. д.). Последний зависит не только от концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического преобразователя, т. е. фермента. Такое использование биосенсоров позволяет изме-


рить активность большого числа ферментов, например, в крови. Так, оценка активности аспартатаминотрансферазы или креатинкииазы, связанных с сердечной деятельностью, позволяет в клинических усло­виях определить степень инфаркта миокарда. Измерение активности амилазы используется в педиатрии.

Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, ис­пользование выполненных на их основе биосеисоров не может быть экономически целесообразным. Поэтому применение бактерий, мик­роорганизмов и биологических тканей различного происхождения более предпочтительно, поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном получении и очистке биокатализаторов. К суще­ственным недостаткам таких биосенсоров можно отнести низкую се­лективность вследствие того, что клетки живых организмов фактиче­ски являются источником самых разнообразных ферментов. Помимо этого время отклика данных устройств на основе тканей и микроорга­низмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их практическую ценность. Тем не менее в последние годы наблюдается повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержа­щих не сами ферменты в очищенном виде, а их первозданные источ­ники — биологические материалы. Так, было установлено, что ткане­вые срезы в биосенсорах могут выполнять функцию источников каталитической активности. Например, создан тест на аскорбиновую кислоту, состоящий из упомянутого электрода Кларка и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна для про­ведения 50 — 80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах. Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности в течение года в 50%-м глицерине.

Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на мембране микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного сенсора. В качестве примера таких устройств можно на­звать амперометрический сенсор, чувствительный к аммиаку (в сточ­ных водах) на основе иммобилизованных нитрифицирующих бакте­рий и кислородного электрода Кларка. Он полезен при решении во­просов охраны окружающей среды, и, в частности, при контроле степе­ни очистки промышленных стоков.

Можно отметить также использование биосенсоров на основе гид-ролаз — ферментов, являющихся катализаторами гидролитического расщепления субстратов. Эти устройства предназначаются, как пра­вило, для эколого-аналитического контроля остаточных количеств пе­стицидов класса фосфорорганических соединений, а также для опре­деления некоторых отравляющих веществ (ОВ). Действие таких био­сенсоров может быть основано на следующих реакциях. Если при гидролизе какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образу­ется электрохимически активное соединение, то, следя за содержанием последнего, можно контролировать ферментативную реакцию так же,


как в предыдущих случаях. Однаков присутствии ингибиторов актив-ность фермента уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, реги­стрируемому электродом, причем чувствительность такова, что изме­нение определяется уже при действии очень малых количеств этих ве­ществ — на уровне пико- и фемтограмм, т. е. Ю~12 — 10~15 моль/л.

С учетом разнообразия ферментов, присутствующих и действую­щих в живом организме и являющихся потенциальными биологиче­скими преобразователями, можно отметить, что существующее сегод­ня число конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз. Эти устройства получают распространение в биотех­нологии. Хотя здесь и встречаются трудности, связанные с невысокой их термической устойчивостью, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания полагать, что данный недостаток будет в скором време­ни преодолен. Так, полагают, что для увеличения срока службы биосен­соров в обозначенных выше условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий и одноклеточных водорос­лей — микроорганизмов, устойчивых к действию высоких темпера­тур. Некоторые из этих устройств работают по принципу «да — нет», что вполне приемлемо, когда решается вопрос о присутствии ультра­малых количеств высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды.

На очереди создание биосенсоров, заменяющих рецепторы живых организмов, что позволит создать искусственные органы обоняния и вкуса, а также применить указанные разработки для возможно более точной и информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых открытий.