Дослідження гетерогенності міоглобіну

3.5.8.1.Фракціонування на іоннообмінниках.

Для хроматографічного аналізу міоглобінів використовують ДЕАЕ-целюльозу або ДЕАЕ-сефадекс. Перед фракціонуванням кристалічний препарат або „пасту” міоглобіну розчиняють у невеликій кількості бідистильованої води, переводять в метформу, додаючи кристалики ферріціаніду калію.

Обладнання і матеріали: колонка з G-25 (діаметром ~2см висотою 50см), іоннообмінник ДЕАЕ-целюльоза, спектрофотометр, метміоглобін.

Реактиви:

1. 0,1 н НCl.

2. 0,1 н NaOH.

3. Фосфатний буфер, рН 6,5:

4. (K₃Fe(CN)_6.).

Трис- НCl буфер, рН 8,3.

Для приготування буферних розчинів для елюції фракцій спочатку готують вихідні розчини 0,2 М KH₂PO₄ (М=139 - 6,804 г розчинити в 250 мл деіонізованої води), 0,2 М NaH₂PO₄ (М=141,96 - 7,098 г розчинити в 250 мл деіонізованої води);

26,2 мл 0,2 М NaH₂PO₄ титруємо 0,2 М розчином KH₂PO₄до рН 6,5.

Для отримання 0,01 М буферу одержаний після титрування буфер розводять деіонізованою водою в 20 разів. Контролюють іонну силу буфера за допомогою кондуктометра.

Хід роботи:

Метміоглобін піддають гельфільтрації на колонці з G-25 для очистки від сульфату амонію. Обезсолений міоглобін фільтрують через G-25 з 0,005 М тріс-НCl буфером, рН 8,5-8,8. Проводять тест – аналіз на визначення рН білка зв’язаного з іоннообмінником. Іоннообмінник, що використовується, активується наступним чином: ДЕАЕ-целюльозу заливають невеликим об’ємом дистиляту, додаючи до смоли, що набухла, 0,1 н NaOH, перемішують на протязі 3-х хв., залишають для декантації маленьких частинок смоли. Потім зливають надосадову частину, яка неосіла на протязі 10 хв. До осаду смоли додають велику кількість води і відмивають NaOH, одночасно декантуючи смолу. За ступенем відмивання від лугу слідкують за допомогою індикаторного паперу. При досягненні нейтрального значення рН додають 0,1 н НCl і витримують смолу такий самий час, як і з NaOH (10 хв.). Відмивають НCl шляхом описаної вище процедури.

Після досягнення нейтрального значення рН до суспензії смоли додають тріс-НCl-буфер, вносять смолу в колонку для хроматографічного аналізу і стабілізують до вихідного стану смоли (рН 8.3, 0,005 М буфер). Попередньо стабілізований білок у вказанному буфері вноситься в колонку і хроматографується при швидкості виходу буфера з колонки, що дорівнює 40 мл в год. Заміну буферів, з зростаючою молярністю проводять по мірі виходу з колонки неадсорбованих компонентів. Вміст білка в пробах визначають спектрофотометрично, використовуючи коефіцієнт екстинції. Будують графік елюції.

Буферний розчин, який витікає з колонки, збирають у пробірки порціями по 1–3 мл. Реєстрацію об’єму елюату, який пройшов через колонку, починають з моменту внесення зразка на колонку. Вміст білка у фракціях визначають спектрофотомертично при 280 нм, або 540 нм. Після закінчення аналізу колонку промивають кількома об’ємами буферного розчину. Складають профіль елюції окремих білкових фракцій.

Елюювання розділених речовин на колонці, зазвичай, проводять розчинами, змінюючи рН, іонну силу (концентрацію) або обидва показники одночасно. У цьому разі градієнт рН та іонної сили може бути ступінчастим або неперервним (плавним). Для створення ступінчастого градієнта використовують серію буферних
розчинів, які пропускають через колонку послідовно один за одним. За такого типу елюювання кожен з елюювальних буферних розчинів пропускають через колонку доти, доки концентрація білка в елюаті, який витікає з колонки, пройшовши через максимум, не знизиться майже до вихідних фонових значень.

У разі елюції з неперервним градієнтом зміна іонної сили та (або) рН елюючого розчину відбувається поступово, лінійно або нелінійно залежно від об’єму рідини, яка протікає через колонку. Лінійну зміну іонної сили або рН елюювального розчину використовують тоді, коли ці параметри змінюються пропорційно до об’єму рідини, яка протікає через колонку. Отримати лінійний градієнт можна за допомогою приладу, який складається з двох з’єднаних між собою однакових ємностей, встановлених на одному рівні (рис. 3.33, а). В одній ємності (1) міститься буферний розчин зі значенням іонної сили (або рН), яке повинне бути досягнуте в кінці досліду, а в іншій – змішувачі (2), з якого розчин безпосередньо поступає в колонку, до змішування міститься однаковий об’єм буферного розчину з вихідною концентрацією. За однакових об’ємів резервуара і камери для змішування виникає лінійний градієнт, а якщо форма камери для змішування змінюється, то можна одержати випуклий або ввігнутий градієнти, у яких іонна сила розчину збільшується або зменшується відповідно до експоненційної залежності. Форму таких градієнтів легко отримати за допомогою простого устаткування, зображеного на рис. 3.33, б, в.

Принцип методу. Розчин, що містить суміш двох і більше речовин, які відрізняються за розміром молекул і молекулярною масою, вносять у колонку заповнену гелем сітчастої структури й урівноважену буферним розчином. Найбільшу швидкість руху на колонці мають компоненти розчину, розміри молекул яких є більшими, ніж розмір пор у гелі. Такі компоненти не проникають у гранули гелевої фази і виходять з колонки першими. Дрібніші молекули, які здатні проникати всередину гелю, безперервно обмінюються між рідкими фазами всередині та назовні гелю і рухаються по колонці значно повільніше. Найдрібніші частинки розчину (наприклад, неорганічні солі) виходять з колонки останніми (див. рис 3.16). На такому принципі ґрунтуються методи фракціонування білків та інших органічних полімерів, їхнє знесолювання, визначення молекулярної маси, заміна одних буферних розчинів іншими та ін.

Досліджувану білкову суміш розводять буферним розчином в об’ємі 1 мл (по 2–4 мг кожного білка) і вносять у колонку. Об’єм внесеного зразка в разі аналітичного розділення повинен бути невеликим (2–3 % від загального об’єму колонки – V_t). У випадку знесолювання його можна збільшити до 20–30 %. Рекомендована концентрація білка – 1 %. Під час аналізу високомолекулярних білків концентрацію зменшують до 0,1–0,5 %. Для збільшення густини розчину додають сахарозу до кінцевої концентрації 0,5 М. Розчин зразка нашаровують під розчинник і він швидко входить у верхній шар наповнювача.

Після внесення зразка колонку знову приєднують до верхнього резервуара, встановлюють необхідну швидкість протікання елюювального розчину, змінюючи робочий тиск, і починають збирати фракції за допомогою колектора. Фракції можна збирати у пробірки за об’ємом (за певною кількістю крапель) або через певні проміжки часу.

Перед використанням визначають вільний об’єм колонки (V₀). Для цього через колонку пропускають 1 мл (1 мг/мл) розчину блакитного декстрану в 0,5 М розчині сахарози. Розчинником для блакитного декстрану і досліджуваних білків є буфер, яким урівноважували колонку. Цим буфером елююють білки з колонки після внесення суміші аналізованих білків. Оскільки позитивно заряджені частинки можуть взаємодіяти з сефадексом (карбоксильними групами), для елюювання використовують буферні розчини з іонною силою понад 0,02. Якщо досліджувані білки після гель-хроматографії піддаються ліофілізації, то для елювання використовують леткі буферні розчини (амоній бікарбонатний, ацетатний, форміатний та ін.).