Хроматографія білків на КМ-целюльозі

Гемоглобін окремих видів тварин складається з близьких по структурі молекул і може бути розділений на фракції. Одним з методів вивчення фракціонного складу гемоглобіну є іоннообомінна хроматографія.

Обладнання: колонка з КМ-целюльозою фірми “Reanal”, спектрофотометр СФ-4А, вага.

Реактиви: 1. 0.5 М NaOH.

2. 0.5 М НCl.

Хід роботи:

Багатокомпонентність гемоглобіну вивчали методом іоннообомінної хроматографії на КМ-целюльозі фірми “Reanal” з номінальною ємкістю 0.7 ± 0.1 екв./г за методикою Петерсона і Собера. Перед заповненням колонок целюльзу 15 хвилин суспендували 5-ти кратною кількістю 0.5 М NaOH, відмивали водою до нейтрального рН. Перемішуючи на протязі 15 хвилин целюльозу 5-ти кратною кількістю 0.5 М НCl, переводили її в Н⁺-форму. Після цього КМ-целюльозу вівмивали бідистильованою водою до нейтральної реакції, суспендували в 0.01 н натрій-фосфатному буфері рН 6.8 (стартовому) та заповнювали колонки розміром 2.8´50 см. Висота гелю дорівнює 40 см. На врівноважену стартовим буфером колонку наносили 400 мг розчину гемоглобіну завчасно діалізовану проти стартового буферу. Елюцію проводили 0.01 н натрій-фосфатним буфером в лінійному градієнті рН 6.8-7.6 на автоматичному апараті для хроматографії. Швидкість елюції 1 мл/хв., об’єм проб 5 мл. Екстинцію вимірювали на спектрофотометрі при 540 нм. За результатами спектрофотометричних вимірів будували криву елюції. Кількісну оцінку окремих фракцій гемоглобіну проводили методом зважування площі ділянок пиків, які окреслені гаусовської кривої.

ДИСК-ЕЛЕКТРОФОРЕЗ

Дослідження гетерогенності взірців проводили методом диск-електофорезу в поліакриламідному гелі, описану Маурером. Цей метод являє собою об’єднаня методів розділення макромолекул по молекулярній масі і заряду та має високу розділяючу здатність.

З хімічною точки зору, поліакриламід який використовуються для електофорезу є сополімером двох мономерів: акриламіду і метиленбісакриламіду. Структура полімеру описується наступною формулою:

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

-СН₂-СН(СОNН)СН2-СН(СО-СН₂)-

Гідрофільні властивості цього гелю викликані наявністю амідних груп, які повторюються через рівні інтервали.

Процес полімеризації акриламіду і метиленбісакриламіду починається в присутності тетраметилметилендіаміна (ТЕМЕД) та каталізатора персульфат амонію ((NH₄)₂SO₄).

Змінюючи концентрацію акриламіду і метиленбісакриламіду можна отримати гель з бажаючими розмірами пор.

При виборі концентрації акриламіду для отримання гелю враховують орієнтовану молекулярну масу фракціонованих речовин і форму їх молекул. Ми використовували гель 7.5%.

Обладнання: скляні трубочки, прилад для електрофорезу, джерело живлення.

Реактиви: Нами була вибрана наступна система для проведення диск-електрофореза:

1. Для приготування гелів:

Реактив А: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 9.16 г

ТЕМЕД - 0.06 мл

Вода (б.дист.) - 25 мл

Реактив В: 1 н НCl - 12 мл

ТРИС - 1.495 г

ТЕМЕД - 0.115 мл

Вода (б/дист.) - 25 мл

Реактив С: метиленбісакриламід - 0.184 г

акриламід - 7 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Реактив D: метиленбісакриламід - 0.625 г

акриламід - 2.5 г

Вода (б. дист.) - 25 мл

Примітка: Акриламід та метиленбісакриламід розчиняти окремо (загальний об’єм зберігається).

Реактив Е: 0.004% рибофлавін (1 мг висушують на протязі доби під H₂SO₄ і розчиняють 25 мл бідистиляту).

Реактив F: 40% cахароза (40 г сахарози до 100 мл води б/д).

Персульфат амонію: 0.14% розчин (14 мг персульфату в 10 мл води б/д).

(Готують безпосередньо перед приготуванням гелю.)

2. Тріс-гліциновий буфер 0.05 М рН 8.3:

Тріс – 6 г + Гліцин – 28,8 г. + Вода бідист. – до 1 л.

Пред заповненням електрофоретичних камер буфер розвести в 10 разів.

3. Фіксуються: 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти.

4. Фарбуються: 0,1% розчином Кумассі G-250 або амідочорним B-10.

Хід роботи:

Одержання дрібнопористого гелю:

Дрібнопористий гель готували в співвідношенні:

А:С: персульфат :Н₂О = 1:2:4:1

Приготовану суміш добре перемішували і заливали в скляні трубочки, які попередньо були запарафіновані з одного кінця. Висота стовбчика, утвореного сумішю в гелі, повинна складати 5-7 см. При внесенні в трубочку слідкувати, щоб не утворювались пухирці. Для створення рівної поверхні гелю зверху на суміш вносять за допомогою шприца декілька крапель бідистиляту. Нашаровувати обережно, щоб не відбувалося змішування із сумішю майбутнього гелю. Полімеризувати в термостаті при температурі 37°С.

Одержання крупнопористого гелю:

Крупнопористий гель готували в співвідношенні: 1

B:D:E:F = 1:2:1:4

В кожну трубочку на отриманий дрібнопористий гель нанести крупнопористий висотою по 0.2-0.4 мл приготованої суміші. Зверху так само нашаровують воду. Полімеризували дрібнопористий гель за допомогою ультрафіолету (на протязі @ 20 хвилин – доки не стане молочно-білим). Забрати фільтрувальним папером воду, перед нанесенням зразка.

Нанесення зразка: Концентрація зразка, що вводиться в трубочку, складає 100-150мкг. Для швидкого визначення концентрації білка можна використовувати спектрофотометричний метод, знаючи коефіцієнт екстинції. Зразок, що вноситься, змішують з 40% розчином сахарози. Об’єм зразка з сахарозою не повинен перевищувати об’єму концентруючого геля.

Електрофорез: Трубки виймають із штативу. знімають парафінове дно, поміщають в електродну камеру. При введені трубок у буфер нижньої електродної камери необхідно слідкувати за тим, щоб на кінцях трубок не було пухирців повітря.

Електрофорез проводити в тріс- гліциновому буфері рН 8,3 на протязі 20 хвилин при силі струму 2 мА на трубочку , а потім при силі струму на одну трубочку складає 4 мА. В якості індикатора використовують бромфеноловий синій, який додають по краплі у верхній буфер (в трубочки). Підключаються електоди так, щоб “плюс” знаходився у нижній камері, а “мінус” – у верхній. В загальному електофорез протікає 1,5-2 години, доки мітка не почне виходити з трубочок.

Фіксування:По закінченню електрофореза гелі видаляються шприцем з тонкою голкою (з водою) і залежно від того чи будемо проводити визначення активності ферментів (1) чи білкових зон (2) занурююмо в розчини: в першому випадку – в рекційну суміш, а в другому - фіксуються 5%-ним розчином ТХО або 7%-ним розчиним оцтової кислоти на протязі 15-20 хвилин, потім відмиваються водою.

Фарбування: фарбуються на протязі 1 години 0,1% розчином Кумассі або амідочорного, надлишок фарби відмивають 7%-ним розчином оцтової кислоти.

Обробка результатів: Одержані результати деситометрують на денситометрі і проводять обробку електрофореграм чи проводили визначення коефіцієнту рухливості (Rf) для кожної з виявлених білкових зон за формулою:

Rf = S₁/S, де

S₁ – пробіг, який пройшла речовина, для якої визначається Rf,

S – загальний пробіг при електорофорезі (від старту до мітки)

3.2. Практична частина

від Іри стр.189

3.2.1. Розділення білкової суміші методом гель-фільтрації

Хроматографія є одним із методів, які використовують для фракціонування білків. Цей метод уперше розроблений для фракціонування низькомолекулярних сполук – вуглеводів та амінокислот. За механізмом розділення хроматографію поділяють на адсорбційну (газову та рідинну), іонообмінну, розподільну, гель-фільтрацію та біоспецифічну (афінну); за формою проведення – на хроматографію на колонці, на папері й у тонкому шарі.

Найпростіше устаткування для хроматографічного розділення на колонках зображене на рис. 3.31.

Рис. 3.31. Схема устаткування для хроматографії на колонках:

1 – пристрій для створення лінійного градієнта (а – ємність із розчином високої концентрації; б – ємність–змішувач; в – магнітна мішалка); 2 – перистальтична помпа; 3 – колонка; 4 – УФ–детектор; 5 – фракції зразка

Колонки (рис. 3.32, 1) – це скляні трубки, розмір яких може коливатися залежно від мети роботи та способу розділення. В основу колонки впаюють пористу скляну пластинку або перфорований диск (рис. 3.32, 2). Комерційні колонки (рис. 3.32, б) мають спеціальні додаткові пристрої – кінцевики-адаптери змінної довжини, які дають змогу регулювати довжину колонки та попереджають процес перемішування фракцій елюату.

Рис. 3.32. Хроматографічні колонки спрощеного (а) та ускладненого (б) варіантів:

1 – скляна колонка; 2 – перфорований диск; 3 – корок із скляною трубкою; 4, 7 – крани-затискачі; 5, 9 – верхні резервуари; 6 – буферний розчин над гелем; 8 – скляний поршень; 10 – адаптери; 11 – сітки з нейлону; 12 – капілярний шланг, з’єднаний із реєструвальним устаткуванням і (або) колектором фракцій; 13 – сорбент

Заповнення колонки має надзвичайно важливе значення для успішного розділення досліджуваних речовин. Колонку закріплюють тільки вертикально, закривають нижній кран (затискач) (рис. 3.32, 4) і наливають у неї приблизно на 1/3 її об’єму дистильовану воду. Енергійними рухами скляного поршня (рис. 3.32, 8) вивільняють простір під диском від бульбашок повітря. На диск за допомогою поршня поміщають кружечок фільтрувального паперу, який за розмірами має точно відповідати внутрішньому діаметру колонки. Поршень обережно виймають, стежачи щоб у колонку не потрапили пухирці повітря. Через лійку або по паличці в колонку наливають густу, ретельно перемішану суміш сорбенту (смоли або гелю) так, щоб рідина стікала по стінці і не захоплювала із собою пухирці повітря. Суспензії дають час для осідання, тоді через кілька хвилин відкривають кран і продовжують заповнювати колонку, поступово доливаючи наступні порції суміші. Для попередження надмірного ущільнення сорбенту колонку заповнюють за невисокого тиску (особливо треба стежити за даним процесом під час роботи з гелем сефадексу). Тиск залежить від величини h (рис. 3.32, а) – різниці між рівнем рідини над сорбентом у колонці (або приєднаному до неї верхньому резервуарі) та положенням кінця шлангу, через який елюат витікає з колонки. Необхідно стежити, щоб наповнення колонки було рівномірним.

Після заповнення колонки до потрібної висоти закривають нижній кран (затискач) і дають суспензії осісти, не допускаючи „висихання” наповнювача в колонці (для цього над верхнім шаром сорбенту в колонці завжди повинен бути шар розчинника). Ще однією вимогою є те, щоб верхній шар наповнювача мав максимально гладеньку горизонтальну поверхню. Для зменшення перемішування верхнього шару під час внесення в колонку зразка над ним інколи розміщують кружечок фільтрувального паперу або поролону. Колонку закривають корком із діркою або зі скляною трубкою і приєднують до резервуара (рис. 3.32, 5), який містить розчин для елюювання зразка. Для підтримання сталого тиску і збереження сталої швидкості витікання рідини через колонку використовують стакан Маріотта або помпи різноманітних конструкцій.

Внесення зразка в колонку можна виконувати кількома способами. Найпростіший із них полягає в такому:

•рідину з поверхні наповнювача обережно забирають, залишаючи шар на 1–2 мм;

•за допомогою піпетки обережно вносять зразок і, відкривши нижній кран, дають йому змогу увійти в шар сорбенту;

•залишки зразка на стінках колонки над сорбентом змивають за допомогою невеликої кількості елюенту;

•після того як він повністю увійде в наповнювач, додають нові порції елюювального розчину, створюючи шар товщиною 5–10 см.

Інший спосіб внесення зразка, під час якого надлишок рідини не видаляють з колонки, полягає у збільшенні густини розчину зразка шляхом додавання сахарози.

Після внесення зразка колонку приєднують до верхнього резервуара, визначають видкість протікання елюювального розчину і починають збирати фракції за допомогою колектора.

Елюювання розділених речовин на колонці, зазвичай, проводять розчинами, змінюючи рН, іонну силу (концентрацію) або обидва показники одночасно. У цьому разі градієнт рН та іонної сили може бути ступінчастим або неперервним (плавним). Для створення ступінчастого градієнта використовують серію буферних
розчинів, які пропускають через колонку послідовно один за одним. За такого типу елюювання кожен з елюювальних буферних розчинів пропускають через колонку доти, доки концентрація білка в елюаті, який витікає з колонки, пройшовши через максимум, не знизиться майже до вихідних фонових значень.

У разі елюції з неперервним градієнтом зміна іонної сили та (або) рН елюючого розчину відбувається поступово, лінійно або нелінійно залежно від об’єму рідини, яка протікає через колонку. Лінійну зміну іонної сили або рН елюювального розчину використовують тоді, коли ці параметри змінюються пропорційно до об’єму рідини, яка протікає через колонку. Отримати лінійний градієнт можна за допомогою приладу, який складається з двох з’єднаних між собою однакових ємностей, встановлених на одному рівні (рис. 3.33, а). В одній ємності (1) міститься буферний розчин зі значенням іонної сили (або рН), яке повинне бути досягнуте в кінці досліду, а в іншій – змішувачі (2), з якого розчин безпосередньо поступає в колонку, до змішування міститься однаковий об’єм буферного розчину з вихідною концентрацією. За однакових об’ємів резервуара і камери для змішування виникає лінійний градієнт, а якщо форма камери для змішування змінюється, то можна одержати випуклий або ввігнутий градієнти, у яких іонна сила розчину збільшується або зменшується відповідно до експоненційної залежності. Форму таких градієнтів легко отримати за допомогою простого устаткування, зображеного на рис. 3.33, б, в.

Принцип методу. Розчин, що містить суміш двох і більше речовин, які відрізняються за розміром молекул і молекулярною масою, вносять у колонку заповнену гелем сітчастої структури й урівноважену буферним розчином. Найбільшу швидкість руху на колонці мають компоненти розчину, розміри молекул яких є більшими, ніж розмір пор у гелі. Такі компоненти не проникають у гранули гелевої фази і виходять з колонки першими. Дрібніші молекули, які здатні проникати всередину гелю, безперервно обмінюються між рідкими фазами всередині та назовні гелю і рухаються по колонці значно повільніше. Найдрібніші частинки розчину (наприклад, неорганічні солі) виходять з колонки останніми (див. рис 3.16). На такому принципі ґрунтуються методи фракціонування білків та інших органічних полімерів, їхнє знесолювання, визначення молекулярної маси, заміна одних буферних розчинів іншими та ін.

Реактиви

1. Натрій-фосфатний або калій-фосфатний буфер – 0,05 М розчини, які містять 0,05 М KСl, рН 6,5.

2. Сефадекс G-100.

Під час роботи із сафедексом йому попередньо дають час набухнути в надлишку розчинника. Час та температура набухання зазначені в інструкціях для кожного типу сефадексу.

3. Білки з відомою молекулярною масою (Да): яєчний альбумін (45 000), бичачий сироватковий альбумін (68 000), рибонуклеаза підшлункової залози (12 700), цитохром с (13 000).

4. Блакитний декстран (м. м. ~ 2 000 000 Да).

5. Сахароза.

Розділення білків на колонках із сефадексом.Сухий сефадекс ресуспендують у 200-кратному об’ємі води і залишають на 48 год за кімнатної температури для повного набухання. Процес набухання можна пришвидшити, якщо проводити його на киплячій водяній бані протягом 5 год.

Колонку (розміром 1,5´50 см; для аналітичного розділення рекомендоване співвідношення довжини до діаметра колонки – 10:1 або 20:1; під час знесолення використовують коротші та ширші колонки) готують так, як описано вище. У неї вносять порівняно густу суспензію повністю набухлого гелю. Щоб уникнути утворення пухирців повітря в шарі гелю на колонці, суспензію сефадексу перед заповненням колонки можна деаерувати за допомогою водоструменевої помпи в колбі Бунзена або вносити його в колонку, підігрівши до температури, яка повинна перевищувати кімнатну (50–60°С). Сефадексу в колонці дають час відстоятися, тоді для врівноваження та досягнення сталої висоти стовпця гелю колонку промивають трьома–п’ятьма об’ємами буферного розчину. Гідростатичний тиск для сефадексу G-100 не повинен перевищувати 50 см: h = 20–50 см (тиск під час розділення зразка і під час заповнення колонки має бути однаковим). Для перевірки рівномірності заповнення через колонку можна пропустити розчин забарвленого білка, наприклад, цитохрому с або блакитного декстрану. Забарвлена зона має бути компактною і рухатися на колонці паралельно до її основи.

Досліджувану білкову суміш розводять буферним розчином в об’ємі 1 мл (по 2–4 мг кожного білка) і вносять у колонку. Об’єм внесеного зразка в разі аналітичного розділення повинен бути невеликим (2–3 % від загального об’єму колонки – V_t). У випадку знесолювання його можна збільшити до 20–30 %. Рекомендована концентрація білка – 1 %. Під час аналізу високомолекулярних білків концентрацію зменшують до 0,1–0,5 %. Для збільшення густини розчину додають сахарозу до кінцевої концентрації 0,5 М. Розчин зразка нашаровують під розчинник і він швидко входить у верхній шар наповнювача.

Після внесення зразка колонку знову приєднують до верхнього резервуара, встановлюють необхідну швидкість протікання елюювального розчину, змінюючи робочий тиск, і починають збирати фракції за допомогою колектора. Фракції можна збирати у пробірки за об’ємом (за певною кількістю крапель) або через певні проміжки часу.

Перед використанням визначають вільний об’єм колонки (V₀). Для цього через колонку пропускають 1 мл (1 мг/мл) розчину блакитного декстрану в 0,5 М розчині сахарози. Розчинником для блакитного декстрану і досліджуваних білків є буфер, яким урівноважували колонку. Цим буфером елююють білки з колонки після внесення суміші аналізованих білків. Оскільки позитивно заряджені частинки можуть взаємодіяти з сефадексом (карбоксильними групами), для елюювання використовують буферні розчини з іонною силою понад 0,02. Якщо досліджувані білки після гель-хроматографії піддаються ліофілізації, то для елювання використовують леткі буферні розчини (амоній бікарбонатний, ацетатний, форміатний та ін.).

Буферний розчин, який витікає з колонки, збирають у пробірки порціями по 1–3 мл. Реєстрацію об’єму елюату, який пройшов через колонку, починають з моменту внесення зразка на колонку. Вміст білка у фракціях визначають спектрофотомертично при 280 нм. Оптичну густину розчинів, які містять рибонуклеазу, визначають при 230 нм, блакитний декстран – при 650 нм, цитохром с – при 412 нм. Після закінчення аналізу колонку промивають кількома об’ємами буферного розчину. Складають профіль елюції окремих білкових фракцій. Для цього будують графік, на горизонтальній осі якого відкладають номери пробірок (фракцій) або об’єм рідини, яка пройшла через колонку, а на вертикальній – значення оптичної густини фракцій (див. рис. 3.16).

Регенерація та зберігання сефадексу. Багаторазове використання колонки із сефадексом призводить до сповільнення протікання рідини через неї. В такому випадку з колонки випаровують гель, регенерують, відмочуючи його від дрібних частинок, і тоді знову заповнюють колонку.

Сефадекси можна зберігати у вигляді суспензії або в сухому стані. Суспензію сефадексу треба зберігати в холодильнику з антисептиками: 0,02 % азиду натрію, мертіолату або хлороформу. Для переведення гелю у сухий стан сефадекс спочатку промивають водою для видалення солей, а тоді витримують кілька хвилин з 2-кратним об’ємом 50% етанолу; після фільтрування на лійці Бухнера сефадекс інкубують у 2-кратному об’ємі 96% етанолу. Обробку етанолом повторюють кілька разів. Осад висушують у термостаті за 60–80°С.