ГЛИБИННИЙ СПОСІБ КУЛЬТИВУВАННЯ МІКРООРГАНІЗМІВ-ПРОДУЦЕНТІВ ФЕРМЕНТІВ
Технологічний процес культивування мікроорганізмів-продуцентів ферментів включає такі стадії: приготування посівного матеріалу в лабораторії; приготування чистої культури мікроорганізмів у виробничих умовах; приготування поживного середовища для ферментації; ферментація.
На спиртових заводах використовують ферментні препарати Глюкаваморин Гх-466, який містить як основний фермент глюкоамілазу і АмІлоглюкаваморин Гх-466, що містить -амілазу і глюкоамілазу у співвідношенні приблизно 1:3. Продуцент в обох випадках - - 466, але різний склад поживного середовища.
Для синтезу -амілази використовують продуценти таін.
Поживні середовища.Вибір середовищ для кожного продуцента проводять дослідним шляхом з врахуванням фізіологічних потреб мікроорганізму й умов його культивування. Для глибинного культивування використовують рідке середовище з додаванням джерел азоту, вуглецю, мікроелементів, активаторів росту і стабілізаторів ферментів.
Джерелом азоту можуть бути фосфат амонію двозаміщений, , ку-
курудзяний екстракт, витяжка із солодових паростків та ін. Кращі результати отримують при поєднанні мінерального й органічного азоту, наприклад, при внесенні дріжджового автолізату, кукурудзяного екстракту та інших природних субстратів, які містять значну кількість аспарагінової і глютамінової кислот.
Джерелом вуглецю для продуцентів амілаз найчастіше є крохмаль різного походження. Може використовуватися кукурудзяна, пшенична або інших культур зерна мука. У процесі приготування живильного середовища крохмаль частково гІд-ролізують ферментами.
Використання середовищ для культивування глюкоамілазних продуцентів аwamогі з високою концентрацією крохмалю дозволяє синтезувати глюкоамілазу концентрацією більше 250 од. в 1 мл культурального середовища.
Наприклад, поживне середовище для 466 складається із кукуру-
дзяного сусла, оцукреного солодом або мікробними ферментними препаратами за технологічним режимом, близьким до спиртового виробництва і містить 18-20 % сухих речовин.
Розмноження посівної культури.Вид і склад посівного матеріалу залежить від продуцента: для грибів це вегетативна міцеліальна маса або спороносна поверхнева, для бактерій - молода культура на початковій стадії спороутворення.
Споровий матеріал гриба - 466 готують у лабораторії в пробір-
ках на агаризованому поживному середовищі, що містить {в %): глюкози - 2,0; нітрат натрію - 0,91; хлорид калію - 0,05; сульфат магнію - 0,05; дигідрофосфат -0,10; сульфат заліза - 0,001. Середовище стерилізують при 0,1 МПа протя-
гом 40 хв. Культуру гриба культивують протягом 12 діб в термостаті при 25° С. Цю культуру використовують для приготування рідкого посівного матеріалу.
Посівну культуру готують у декілька стадій, поступово збільшуючи масу культури продуцента.
Для гриба готують рідке середовище такого складу (в %): куку-
рудзяна мука - 5,0; вода - 94,5. рН середовища доводять розчином до 4,8.
Приготоване середовище розливають у качалочні колби по 300 мл в кожну і стерилізують при 120-125° С упродовж 40-60 хв. Після охолодження до 26° С в середовище засівають суспензію конідій з пробірок. Вирощування на качалках проводять при температурі 24-26° С упродовж 36-48 год. Готову культуру передають на другу стадію.
Живильне середовище для другої стадії культивування таке ж, як і для першої. Стерильне середовище розливають в ємкості 6 л по 2,5 л в кожну і засівають посівною культурою першої стадії в кількості 10-12 % до об'єму середовища. Культивують упродовж 48 год при 24-26° С.
----------------------------------------- Одержання солоду та мікробних ферментних препаратів------------
У третій стадії посівну культуру вирощують у виробничих умовах в інокуля-торах на кукурудзяному суслі концентрацією 6 % СР протягом 48 год при температурі 27° С. Середовище перемішують мішалкою і аерують з інтенсивністю 16 м3/ (м3· ). Об'єм посівного матеріалу із другої стадії складає 0,5-1,0 % до об'єму поживного середовища в їнокуляторі.
Посівну культуру продуцентів 466 або ВУД Т-2 можна виро-
щувати за спрощеною схемою приготування спорового замість вегетативного посівного матеріалу. Вихідну культуру пересівають з пробірки на агаризованому поживному середовищі в колби зі стерильними висівками, які витримують в термостаті до повного дозрівання культури. Безпосередньо з колб посівний матеріал у вигляді водної суспензії спор пересівають у виробничий ферментатор. Тривалість вирощування виробничої культури при цьому не збільшується при високій активності культури.
Культивування на всіх стадіях проводять при оптимальних температурі, інтенсивності аерації і тривалості процесу. Посівний матеріал не повинен бути інфікований контамінуючою мікрофлорою, в ньому мають зберігатися стійкі властивості продукування ферментів.
Промислове вирощування культури.Процес вирощування глибинної культури у виробництві здійснюють у ферментаторі з нержавіючої сталі в стерильних умовах при постійному перемішуванні й аеруванні середовища.
Процес проводять періодичним способом постадійно: підготовка ферментатора до прийому поживного середовища, приготування поживного середовища, стерилізація поживного середовища, охолодження і засів поживного середовища в ферментаторі, ферментація.
Розглянемо технологічну схему глибинного культивування для
виробництва ферментного препарату Глюкаваморин Гх-466 (рис. 4.9).
Посівний матеріал готують у виробничому інокуляторі 23, який має аератор, мішалку й оболонку для охолодження.
Живильним середовищем є кукурудзяне сусло (або інших зернових культур), яке готують у змішувачі 15 і яке містить 6% сухих речовин. У змішувач 15 набирають воду і при постійному перемішуванні перекачують насосом 19 сусло з оцукрювача. Співвідношення сусла і води повинно бути 1:2. Після ретельного перемішування живильне середовище нагрівають у контактній головці до 85° С шляхом багаторазового перкачування насосом 16.
Підігріте середовище передають у підготовлений посівний апарат. Для запобігання утворення піни перед підігрівом у середовище додають соняшникову олію з розрахунку 0,10...0,15 % його об'єму.
У посівному апараті 23 середовище спочатку підігрівають до 100° С гострою парою, яку подають через форсунку, лінію передавлювання і нижній спускний штуцер при відкритій вихлопній повітряній лінії. Потім вентиль на вихлопній лінії закривають, і температура середовища піднімається до 121-123° С (тиск 0,1... 0,15 МПа витримують впродовж 1 год). Після закінчення стерилізації тиск в апараті поступово знижують до 0,03...0,05 МПа. Потім в апарат подають стерильне повіт-
Рис. 4.9 Апаратурно-технологічна схема виробництва Глюкаваморину Гх-466: 1 - фільтр грубого очищення; 2 - компресор; 3 - вологовідділювач; 4, 21 - теплообмінники; 5 - масловідділювач; 6, 22, 25 - фільтри; 7 - шнек для подачі муки; 8 - змішувач; 9, 16, 19, 27, 29 - насоси; 10 - варильний апарат; 11 - оцукрговач; 12 - солододробарка; 13 - збірник солодового молока; 14 - дозатор; 15 - змішувач; 17, 18 - контактні головки; 20 - стерилізатор; 23 - інокулятор; 24 - ферментер; 26 - збірник піногасника; 28 - скрубер
ря для підтримання надлишкового тиску в ньому 0,02...0,03 МПа, а в охолоджувальну оболонку апарата поступає холодна вода.
Після охолодження маси до 27° С живильне середовище засівають культурою, одержаною на другій стадії, в кількості 0,5... 1,0 % через посівний люк з додержанням стерильних умов.
Режим вирощування посівного матеріалу: тиск в апараті 0,02...0,03 МПа, температура 27...28° С, інтенсивність аерування 16 м3 / (м3 • год), частота обертів мішалки 5,8 с-1. Тривалість вирощування посівного матеріалу 24 год.
Через 12 год після початку вирощування і перед посівом у ферментер у стерильних умовах з апарата відбирають проби для визначення рН, контамінуючої мікрофлори, концентрації сухих речовин.
Глибинну культуру вирощують у ферментері в стерильних умовах при безперервному перемішуванні й аеруванні середовища.
Процес вирощування глибинної культури складається з таких стадій: підготовка ферментера до внесення живильного середовища, приготування живильного середовища, його стерилізація, охолодження і засів живильного середовища посівною культурою в ферментері, ферментація.
Ферментер 24 має пароводяну оболонку, аератор, патрубки для підводу пари, посівну і спускну лінії, гільзу для термометра, штуцер для манометра, паровідбір-ник, піногасний збірник та Індивідуальний повітряний фільтр.
Підготовка ферментера до внесення живильного середовища включає миття, огляд, перевірку герметичності і стерилізацію при температурі 120...125 0С впродовж 60 хв.
Після зняття тиску й охолодження до температури 27...28° С в ферментер подають живильне середовище.
Для приготування живильного середовища використовують кукурудзяне (або пшеничне) сусло з концентрацією сухих речовин 18...20 %, яке одержують за такою схемою: кукурудзяну муку через порційні автоматичні ваги шнеком 7 завантажують у змішувач 8, в який одночасно і при постійній роботі мішалки подають воду температурою не більше 45° С. Співвідношення муки і води 1:(2,5...3,0).
Одержану масу насосом 9 перекачують у варильний апарат 10, який працює під тиском. Масу в апараті нагрівають гострою парою, яку підводять знизу. Розварювання проводять при температурі 143...145° С, тиску 0,3...0,4 МПа протягом 15 - 20 хв. Розварена маса поступає в оцукрювач 11, обладнаний змійовиком для охолодження. Перед подачею маси в оцукрювач додають воду в кількості 5 % об'єму розвареної маси.
Розварену масу охолоджують до 63° С й оцукрюють солодовим молоком, яке одержують змішуванням у ємностях 13 подрібненого на дробарці 12 солоду і води. Співвідношення солоду і води 1:(6...8). Тривалість оцукрювання при температурі 58...600 С складає ЗО хв.
Живильне середовище концентрацією сухих речовин 18... 20 %, рН 5,3...5,6 і температурою 75...80° С із оцукрювача 11 насосом 19 подають через контактну голівку 18, де воно нагрівається до 120...125° С, в трубчатий стерилізатор 20, де витримується 30...40 хв, потім охолоджується в теплообміннику 21 до 35° С і поступає в ферментер, у якому в процесі заповнення підтримується тиск 0,1...0,12 МПа.
Після заповнення ферментера всю систему звільняють від середовища, промивають водою і стерилізують парою впродовж 30...40 хв при 0,20... 0,25 МПа. При звільненні та прокачці системи живильне середовище і вода спускаються в змішувач 15. Витрати води при цьому повинні в 2...3 рази перевищувати об'єм системи.
Середовище засівається в ферментер лінією передавлювання, попередньо простерилізованою гострою парою впродовж 1 год.
Перед засівом із ферментера відбирають проби середовища через пробовідбірник для мікробіологічного висіву (на м'ясо-пептонний бульйон або м'ясо-пептон-ний агар) і біохімічного аналізу. На вихідній повітряній лінії біля посівного апарата закривають вентиль і піднімають тиск до 0,06...0,08 МПа, а в ферментері залишають тиск 0,02...0,03 МПа. Після цього відкривають вентиль на лінії передавлювання посівного апарата в ферментер, і посівна культура в результаті різниці тисків поступає в ферментер. Закривають вентиль на лінії передавлювання, включають змішувач і починають процес вирощування культури в ферментері. Кількість посівного матеріалу складає 3 % об'єму живильного середовища в апараті.
Режим вирощування культури: температура 34... 35° С, тиск 0,02...0,03 МПа, інтенсивність аерування 30...60 м3/(м3 • год), частота обертів мішалки 2,5...2,8 с-1, тривалість вирощування 120-160 год.
Необхідно строго слідкувати за стерильністю повітря для аерування. Від механічних домішок і мікроорганізмів повітря очищується за допомогою систем потрійного очищення, для цього перед компресором встановлюють висциновий фільтр грубого очищення 1.
Повітря подають компресором 2. Волога і масло відділяються з повітрям в відділювачі вологи 3 і масловідділювачі 5.
У теплообміннику 4 повітря підігрівається до 60... 80° С в залежності від температури зовнішнього повітря. Очищення повітря від мікрофлори проходить в загальному (головному) фільтрі 6, який заповнений базальтовим волокном. Після цього фільтру повітря поступає в колектор, а потім додатково очищується в індивідуальних фільтрах 22 і 25, які заповнені базальтовим волокном і встановлені відповідно перед кожним маточником і ферментером.
Індивідуальні фільтри стерилізуються разом з посівним апаратом і ферментером гострою парою впродовж 2 год при тиску 0,18...0,20 МПа. Волога із фільтрів видаляється продуванням через них гарячого повітря.
Необхідно систематично контролювати стерильність повітря, що поступає на аерування. Для перевірки стерильності повітря колбу місткістю 0,5... 1,0 л з 100...150 мл стерильного м'ясо-пептонного бульйону стерильно приєднують до спеціального пробного крану повітропроводу і продувають повітря через м'ясо-пептонний бульйон впродовж 10... 12 год, в цьому процесі бульйон не повинен сильно пінитися. Потім щільно зажимають шланги виходу і входу повітря, закривають пробний кран повітропроводу, від'єднують колбу і витримують її в термостаті при 37 + 0,5° С впродовж 48 год. Наявність навіть незначного помутніння вказує на нестерильність повітря.
Для мікробіологічного і біохімічного контролю розвитку культури з дотриманням усіх умов стерильності відбирають проби із ферментера: на початку через 72 год після посіву, а потім через кожну добу росту. У пробах визначають глюкоамі-лазну активність, рН, концентрацію сухих речовин, стерильність, стан культури.
Готовий ферментний препарат Глюкаваморин Гх повинен відповідати таким вимогам: активність глюкоамілази не менше 200 од./см3; концентрація сухих речовин у фільтраті 8...10%; рН 3,0...3,5; контамінуюча мікрофлора відсутня.
У випадку розвитку контамінуючої мікрофлори ферментер стерилізують протягом 2 год при 126...133° С і тиску 0,18...0,20 МПа, а препарат подають на мікрофі-льтраційну систему. Інфікування ферментера не допускається.
Готовий препарат насосом подають у стерильні збірники, в яких є система охолодження до 8... 12° С.
На такій же установці можна отримувати і інші ферментні препарати: Аміло-діастатин Гх, Глюкобататин Гх, Амілорізин Гх та ін. Відмінності, зумовлені біологічними особливостями мікроорганізмів, полягають у різних способах ведення посівного матеріалу і технологічних режимах вирощування мікроорганізмів, різному складові живильних середовищ.
----------------------------------------- Одержання солоду та мікробних ферментних препаратів-------------
Після закінчення ферментації в ферментер при перемішуванні додають 40 %-ний розчин формаліну з розрахунку 2 л на 1 м3 культуральної рідини. Після цього препарат перекачують у розхідні збірники.
Витрати глибинної культури мікроорганізмів, а також концентрованих ферментних препаратів на оцукрювання розвареної маси розраховують за їх активністю.
Ферментний препарат 466 має незначну кількість -аміла-
зи, тому його необхідно використовувати в суміші з іншими препаратами -амілази, наприклад, Амілосубтиліном Гх. Витрати ферментів розраховують за нормами в одиницях активності на 1 г перероблюваного крохмалю сировини. Ці витрати змінюються в залежності від прийнятої тривалості бродіння. При 72-годинному бродінні витрати -амілази складають 1,5... 2,0 од. АЗ, глюкоамілази - 6 од. на 1 г крохмалю. При 48-годинному бродінні витрати -амілази залишаються такі ж, а глюкоамілази збільшуються до 15 од. ГлА на 1 г крохмалю. У цьому випадку досягають рівних показників дозрілої бражки.
Ферментний препарат можна використовувати і в суміші з солодом. Наприклад, при 72-годинному бродінні і витратах зерна на солод 5 % маси переробленого крохмалю необхідно 4 од. ГлА на 1 г крохмалю.
Найбільш ефективний спосіб концентрування глибинних культур - це ультрафільтрація.
Контрольні питання і завдання
1. Характеристика оцукрюючих матеріалів.
2. Механізм дії ферментів.
3. Кінетика ферментативних реакцій.
4. Класифікація і номенклатура ферментів.
5. Які умови замочування і пророщування зерна.
6. Технологія солоду з механоактивацією ферментів.
7. Глибинний спосіб культивування мікроорганізмів - продуцентів ферментів.
РОЗДІЛ 5